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Molecular mechanism controlling the ADGRV1 activity, a GPCR protein involved in deafness and blindness.
No full textLes récepteurs couplés aux protéines G d'adhésion (aGPCR) jouent un rôle crucial dans de nombreuses fonctions biologiques de signalisation cellulaire. Parmi eux, ADGRV1 est essentiel dans les cellules sensorielles de l'audition et de la vision. Des mutations de cette protéine sont associées au syndrome d'Usher de type 2, une maladie génétique causant à la fois la surdité et la cécité chez l'Homme. En effet, dans les cellules ciliées, la grande région extracellulaire d'ADGRV1 compose des liens protéiques nécessaires au développement et au maintien de stéréocils mécanosensibles cruciaux pour l'audition. Dans les photorécepteurs, ADGRV1 est impliquée dans le transport de photopigments, nécessaires à la vision. Par ailleurs, la protéine a une activité de signalisation cellulaire démontrée dans des cellules modèles. Mon projet de thèse concerne l'activité GPCR et la structure d'ADGRV1, un récepteur orphelin, dont les mécanismes moléculaires de signalisation et de régulation sont inconnus. Dans cette étude, j'ai produit, purifié puis étudié les caractéristiques biophysiques d'ADGRV1β (47kDa) composé de sa partie GPCR et de son domaine intracellulaire, montrant sa pureté, sa stabilité et son état monomérique en micelle de détergent. Nous avons en parallèle produit des VHHs spécifiques du récepteur pour son étude structurale. Parmi ceux-ci, le VHH RE02 interagit avec ADGRV1β avec une forte affinité nanomolaire. La structure atomique du complexe ADGRV1β/RE02 a été résolue à une résolution de 3.8 Å par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), décrivant l'état inactif du récepteur. L'analyse a montré l'absence de liaison de l'agoniste intramoléculaire des aGPCR appelé le peptide Stachel N-terminal, dans la poche orthostérique qui est maintenue compacte par des interactions hydrophobes essentiellement entre les segments transmembranaires. Une particularité de la structure inactive d'ADGRV1β est une longue boucle intracellulaire dont le repliement unique et stable encombre potentiellement le site de liaison aux protéines G. Afin de mieux comprendre l'activation d'ADGRV1β, un complexe GPCR/protéine Gi a été formé et étudié par cryo-EM. Son instabilité reflète une faible activation du récepteur. Ce résultat est cohérent avec nos études fonctionnelles en cellule qui montre une faible activité constitutive du récepteur passant par Gi, et qui est indépendante du peptide Stachel. Ces caractéristiques particulières d'ADGRV1, par rapport aux autres aGPCRs étudiés, peuvent être liées à son peptide Stachel non-consensus et à l'absence de résidu nécessaire à la transition conformationnelle du récepteur vers sa forme active. Enfin, des expériences de protéomique ont identifié la kinase GRK2, spécifique des GPCRs, comme un partenaire potentiel d'ADGRV1, ouvrant des perspectives sur l'activation d'autres voies de signalisation par le récepteur, notamment celle impliquant les arrestines.Adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs) play a crucial role in many biological cells signaling functions. Among them, ADGRV1 is essential in the sensory cells of hearing and vision. Mutations in this protein are associated with Usher syndrome type 2, a genetic disease causing both deafness and blindness in humans. In hair cells, the large extracellular region of ADGRV1 forms the protein links required for the development and maintenance of mechanosensitive stereocilia that are crucial for hearing. In photoreceptors, ADGRV1 is involved in the transport of photopigments, which are essential for vision. The protein has also been shown to have signaling activity in model cells. My thesis project concerns the GPCR activity and structure of ADGRV1, an orphan receptor of which the molecular signaling and regulatory mechanisms are unknown.In this study, I produced, purified and then studied the biophysical characteristics of ADGRV1β (47kDa), composed of its GPCR part and its intracellular domain, showing its purity, stability and monomeric state in detergent micelles. In parallel, we produced receptor-specific VHHs for structural determination. Among these, the VHH RE02 interacts with ADGRV1β with a high nanomolar affinity. The atomic structure of the ADGRV1β/RE02 complex was resolved at 3.8 Å resolution by cryo-electron microscopy (cryo-EM), describing the inactive state of the receptor. The analysis showed the absence of binding of the intramolecular aGPCR agonist, the N-terminal Stachel peptide, in the orthosteric pocket, which is held compact by hydrophobic interactions mainly between the transmembrane segments. A particular feature of the inactive structure of ADGRV1β is a long intracellular loop whose unique and stable folding potentially obstructs the G protein binding site. To better understand the activation of ADGRV1β, a GPCR/Gi protein complex was formed and studied by cryo-EM. Its instability reflects low receptor activation. This result is consistent with our functional studies in cells, which show low constitutive activity of the receptor passing through Gi, and which is independent of the Stachel peptide. These particular characteristics of ADGRV1, compared with the other aGPCRs studied, may be related to its lack of consensus Stachel peptide and the absence of the residue required for the conformational transition of the receptor to its active form. Finally, proteomics experiments have identified the GPCR-specific kinase GRK2 as a potential partner for ADGRV1, raising the possibility that the receptor may activate other signaling pathways, particularly those involving arrestins
Functional and structural studies of t⁶A tRNA modification systems in the three domains of life.
No full textLa thréonylcarbamoylation de la base A37 des ARNt de type ANN (t⁶A) est universelle au sein des trois domaines du vivant car essentielle au bon fonctionnement de la cellule. La synthèse se catalyse en deux étapes, dont la première est assurée par la famille d’enzymes YrdC/Sua5, qui forme l'intermédiaire thréonyl-carbamoyle-AMP et la seconde par Kae1/OSGEP/Qri7/TsaD qui transfère le groupement thréonyl-carbamoyle du TC-AMP sur les ARNt substrats. La seconde famille d'enzymes requiert des partenaires protéiques différents selon le domaine du vivant. Le but de cette thèse était de comprendre les différents systèmes de biosynthèse du t⁶A au niveau moléculaire en utilisant des techniques biochimiques et structurales (la diffraction des rayons X (cristallographie), la diffusion des rayons X en solution (SAXS) et la cryo-microscopie électronique). La structure quaternaire du complexe TsaBDE de Thermotoga maritima a été résolue mettant en lumière les changements conformationnels de la sous-unité catalytique TsaD qui se traduit par une ouverture et une perturbation partielle du site actif induits par la présence de TsaE. Combinés à des données biochimiques, il apparaît que ce remodelage est nécessaire au recyclage du site catalytique. Chez l'Homme, la structure du sous-complexe OSGEP-LAGE3-GON7 a été résolue mettant en évidence que GON7, intrinsèquement désordonnée en solution, se structure au contact de LAGE3. L'étude structurale du complexe humain par SAXS combinée aux études génétiques et biochimiques montrent que GON7 stabilise le complexe sous forme pentamérique. Ces données ont été indispensable pour mieux comprendre les bases moléculaires d’une maladie génétique rare (le syndrome de Galloway-Mowat) causée par des mutations dans toutes les protéines de la voie de synthèse du t⁶A. Enfin, une cinquième sous-unité a été identifiée comme potentielle homologue de GON7 chez les Archées. Son étude structurale montre que la structure est différente de celle de GON7. Cependant, cette protéine stabilise le complexe sous forme pentamérique, mimant l'effet de GON7 chez les eucaryotes.The t⁶A modification of the A37 position of ANN-type tRNAs is totally conserved in the 3 domains of life as it is essential to the general functioning of the cell. It is carried out in two catalytic steps : the YrdC/Sua5 enzyme family, first, synthetizes the thréonyl-carbamoyle-AMP (TC-AMP) intermediate, then the Kae1/OSGEP/Qri7/TsaD enzyme family transfers the threonyl-carbamoyl moiety of TC-AMP onto the tRNA substrate. The enzymes that are responsible for the transfer step use different protein partners in bacteria, archaea and eukaryotes. The aim of this thesis was to understand at a molecular level these various threonylcarbamoylation systems using a combination of biochemical and biophysical techniques (crystallography, X-ray scattering in solution (SAXS) and cryo-electron microscopy). The structure of the ternary TsaBDE complex of Thermotoga maritima was solved, highlighting conformational changes of TsaD that result in its opening and the partial melting of its active site induced by its interaction with TsaE. Combined with biochemical data, it was concluded that this conformational change seems necessary to promote multiple catalytic turnovers. In Humans, the structure of the OSGEP-LAGE3-GON7 KEOPS sub-complex has been solved, showing that GON7, which is intrinsically disordered in solution, becomes structured upon interaction with LAGE3. The study of the structural properties of the whole human complex showed that GON7 stabilizes a pentameric form of the complex. These data were indispensable for a better comprehension of the molecular basis of a rare genetic disease (Galloway-Mowat syndrome) caused by mutations in all subunits of the t⁶A biosynthesis proteins. Finally, a fifth subunit has been identified as the potential homologue of GON7 in Archaea. However its structural study shows that the fold is different from GON7’s. Nevertheless, this protein stabilizes the archaeal complex in a pentameric form, as GON7 does in Eukaryotes
Structural and functional study of the KEOPS complex
No full textKEOPS est un complexe multiprotéique essentiel, présent chez les archées et les eucaryotes. Il catalyse la threonylcarbamoylation de l'adénosine en position 37 (t6A) des ARN de transfert (ARNt) reconnaissant les codons ANN. Cette modification est nécessaire à l'initiation de la traduction ainsi qu'à son efficacité. KEOPS humain (HsKEOPS) est composé de 5 sous-unités : TPRKB, TP53RK, OSGEP, LAGE3 et GON7. Récemment, de nombreuses mutations ont été identifiées au sein des 5 gènes codants pour HsKEOPS chez 30 familles avec des enfants présentant une microcéphalie congénitale, un retard de développement et un syndrome néphrotique cortico-résistant, les principaux traits du syndrome de Galloway-Mowat (GAMOS). OSGEP porte l'activité catalytique t6A mais le rôle des autres sous-unités n'est pas bien compris. Mon projet de thèse combine biochimie et biologie structurale pour mieux comprendre : (1) le rôle et la fonction de toutes les sous-unités du complexe KEOPS et (2) les défauts moléculaires des mutants causant le syndrome de Galloway-Mowat. Un élément clé manquant pour cette compréhension réside dans la résolution de la structure 3D du complexe KEOPS avec son ARNt substrat.Lors de ma thèse, 3 structures inédites ont été résolues par cryo-microscopie électronique correspondant au HsKEOPS, au complexe HsKEOPS-ARNt et à un sous-complexe de HsKEOPS(TPRKB-TP53RK-OSGEP)-ARNt. La structure de HsKEOPS en interaction avec l'ARNt correspond à la première structure résolue d'un complexe protéique participant à la catalyse de la modification t6A en interaction avec un ARNt. L'ARNt y interagit avec 4 sous-unités (TPRKB, TP53RK, OSGEP et LAGE3). TPRKB interagit avec la queue CCA de l'ARNt tandis que la boucle anticodon se trouve à l'entrée du site actif d'OSGEP. Des changements de structure quaternaire sont observés vis-à-vis du complexe HsKEOPS seul, permettant d'accommoder l'ARNt. Le sous-complexe présente une position différente de l'ARNt qui n'interagit pas avec OSGEP, ce qui pourrait correspondre à une étape précoce de l'interaction entre HsKEOPS et l'ARNt. A partir d'un modèle de HsKEOPS-ARNt fixé à l'intermédiaire TC-AMP, nous avons pu constater que la mutation de résidus au contact avec le TC-AMP diminuent fortement l'activité t6A, confortant le modèle.Une étude de mutants ponctuels a mis en évidence que TPRKB joue un rôle important dans l'interaction avec l'ARNt ; que les interactions avec les résidus du site actif contribuent peu à l'affinité globale avec l'ARNt mais sont probablement importantes pour le bon positionnement de la boucle anticodon vers le TC-AMP ; et que TP53RK interagit à la fois avec les domaines anticodon et accepteur, porte l'activité ATPase et contribue à l'activité de modification t6A grâce à son hélice C-terminale qui va guider la boucle anticodon de l'ARNt vers le site actif d'OSGEP.Enfin, la capacité à synthétiser la modification t6A (in vitro et dans la levure humanisée), l'activité ATPase du complexe ainsi que la capacité à fixer l'ARNt des mutants GAMOS ont été comparées aux valeurs du complexe sauvage. Tous les mutants GAMOS ont pu être produits et purifiés montrant que les mutations GAMOS n'altèrent pas la structure globale ou le repliement du complexe KEOPS. La plupart des mutations sont liées à une déficience de l'activité t6A in vitro et dans la levure. Certaines mutations présentent une activité t6A plus élevée mais sont principalement associées à une mutation "faible activité" chez les patients hétérozygotes. Il semble donc qu'il y a un réglage fin du niveau de t6A dans la cellule. Les données ont également été discutées au regard de la structure du complexe HsKEOPS-ARNt, montrant que les mutants GAMOS qui se trouvent à l'interface entre OSGEP et TP53RK vont perturber à la fois l'activité ATPase et t6A de KEOPS, et que plusieurs mutants d'OSGEP proches du site actif forment un réseau d'interaction dont l'interruption va fortement impacter l'activité t6A de KEOPS.KEOPS is an essential multiprotein complex found in archaea and eukaryotes. It catalyses the threonylcarbamoylation of adenosine at position 37 (t6A) of transfer RNAs (tRNAs) recognising ANN codons. This modification is necessary for translation initiation and efficiency. Human KEOPS (HsKEOPS) is composed of 5 subunits: TPRKB, TP53RK, OSGEP, LAGE3 and GON7. Recently, numerous mutations have been identified in the 5 genes encoding HsKEOPS in 30 families with children presenting with congenital microcephaly, developmental delay and cortico-resistant nephrotic syndrome, the main features of Galloway-Mowat syndrome (GAMOS). OSGEP carries t6A catalytic activity but the role of other subunits is not well understood. My thesis project combines biochemistry and structural biology to better understand: (1) the role and function of all subunits of the KEOPS complex and (2) the molecular defects in mutants causing Galloway-Mowat syndrome. A key missing element in this understanding is the resolution of the 3D structure of the KEOPS complex with its tRNA substrate.During my thesis, 3 novel structures were solved by cryo-electron microscopy corresponding to HsKEOPS, the HsKEOPS-tRNA complex and a sub-complex of HsKEOPS(TPRKB-TP53RK-OSGEP)-tRNA. The structure of HsKEOPS in interaction with tRNA corresponds to the first solved structure of a protein complex involved in catalysis of the t6A modification in interaction with a tRNA. The tRNA interacts with 4 subunits (TPRKB, TP53RK, OSGEP and LAGE3). TPRKB interacts with the CCA tail of the tRNA, while the anticodon loop is located at the entrance to the OSGEP active site. Quaternary structural changes are observed with respect to the HsKEOPS complex alone, allowing tRNA to be accommodated. The sub-complex has a different tRNA position that does not interact with OSGEP, which may represent an early stage of interaction between HsKEOPS and tRNA. Using a model of HsKEOPS-tRNA bound to the TC-AMP intermediate, we found that mutation of residues in contact with TC-AMP strongly decreased t6A activity, supporting the model.A study based on point mutations revealed that TPRKB plays an important role in the interaction with tRNA ; that interactions with active site residues contribute little to the overall affinity with tRNA but are probably important for the correct positioning of the anticodon loop towards TC-AMP ; TP53RK interacts with both the anticodon and acceptor domains, carries ATPase activity and contributes to t6A modification activity via its C-terminal helix, which guides the tRNA anticodon loop to the OSGEP active site.Finally, the capacity to synthesise the t6A modification (in vitro and in humanised yeast), the ATPase activity of the complex and the capacity to bind tRNA of the GAMOS mutants were compared to the values of the wild-type complex. All GAMOS mutants were produced and purified, showing that GAMOS mutations do not alter the overall structure or folding of the KEOPS complex. Most of the mutations are linked to a deficiency in t6A activity in vitro and in yeast. Some mutations show higher t6A activity but are mainly associated with a "low activity" mutation in heterozygous patients. This suggests that there is fine-tuning of t6A levels in the cell. The data were also discussed in relation to the structure of the HsKEOPS-tRNA complex, showing that GAMOS mutants at the interface between OSGEP and TP53RK will disrupt both the ATPase and t6A activity of KEOPS, and that several OSGEP mutants close to the active site form an interaction network whose disruption will strongly impact the t6A activity of KEOPS
Recherche et aménagement en milieu forestier tropical humide : le projet Taï de Côte d'Ivoire
No full textOd opisu iluzji do ich wykorzystania w argumentacji
No full textProponowana refleksja polega na przyjrzeniu się prototypowi wybranemu przez autorów Traktatu argumentacji (Traité de l'argumentation,1958) do wyjaśnienia struktury dysocjacji argumentacyjnej: iluzji percepcyjnej wytwarzanej przez refrakcję. Wybór takiego przykładu może być zaskoczeniem, biorąc pod uwagę, że w ogólnych debatach dysocjacje argumentacyjne są znacznie częściej typu opinia/prawda niż typu wygląd (lub percepcja)/rzeczywistość. Intuicja Perelmana i Olbrechts-Tyteca może jednak odpowiadać tendencji specyficznej dla słownictwa używanego w argumentacji. Według Turco i Coltier (1988), niektóre znaczniki argumentacyjne, które nie odpowiadają konkretnym rzeczywistościom, zostały zapożyczone z bardziej namacalnego słownictwa przestrzeni i czasu (na przykład, or, alors, dès lors, dla czasu, lub d’un côté, d’un autre côté, dla przestrzeni). Hipoteza robocza polega na przyjęciu tej propozycji w celu zidentyfikowania, które struktury przydatne do opisania konkretnej iluzji percepcyjnej mogą być użyte do zaznaczenia obecności dysocjacji argumentacyjnej. Musimy również rozważyć, jakie adaptacje mogą umożliwić rozróżnienie między użyciem opisowym (opisującym iluzję percepcyjną) a użyciem argumentacyjnym (oznaczającym dysocjację argumentacyjną). Na przykład, w przypadku czasownika sembler, opisy iluzji zwykle nie określają celownika, ponieważ iluzja jest ogólnie postrzegana przez każdą osobę znajdującą się w sytuacji umożliwiającej obserwację takiego zjawiska (Vue de loin, une tour carrée semblera ronde); w dysocjacji argumentacyjnej, w przeciwieństwie do tak zwanych zastosowań łagodzących (emplois de mitigation), prototypowym zastosowaniem jest użycie trzeciej osoby do oznaczenia autora przeciwnej opinii, osoby wyraźnie różniącej się od mówiącego (Il lui/leur semble que p. Or, q). Badanie opisu złudzeń percepcyjnych opiera się na pracy Jacquesa Ninnio (La science des illusions, 1998), która jest porównywana z korpusem tekstów argumentacyjnych przeznaczonych dla uczniów ostatnich klas.The proposed reflection involves looking at the prototype chosen by the authors of the Treatise on Argumentation (1958) to explain the structure of an argumentative dissociation: the perceptual illusion produced by refraction. The choice of such an example may come as a surprise given that, in debates on ideas, argumentative dissociations are much more often of the opinion/truth type than of the appearance (or perception)/reality type. Perelman and Olbrechts-Tyteca's intuition could, however, correspond to a tendency specific to the vocabulary used in argumentation. According to Turco and Coltier (1988), certain argumentative markers that do not correspond to concrete realities have been borrowed from the more tangible vocabulary of space and time (for example, or, alors, dès lors, for time, or on the one hand, on the other hand, for space). The working hypothesis is to take up this proposal in order to identify which structures useful for describing a concrete perceptual illusion can be used to mark the presence of an argumentative dissociation. We also need to ask what adaptations might make it possible to distinguish between a descriptive use (describing a perceptual illusion) and an argumentative use (marking an argumentative dissociation). For example, with the verb to seem, descriptions of illusions will not usually specify a dative because the illusion is generally perceived by any individual in a position to observe such a phenomenon (Vue de loin, une tour carrée semblera ronde); in argumentative dissociation, and in contrast to so-called mitigation uses, the prototypical use will consist instead of using a third person to designate the author of an opposing opinion, a person clearly distinct from that of the speaker (Il lui/leur semble que p. Or, q). The study of the description of perceptual illusions is based on a work by Jacques Ninnio (La science des illusions, 1998), which is compared with a corpus of argumentative texts intended for final year pupils.La réflexion proposée consiste à s’interroger sur le prototype choisi par les auteurs du Traité de l’argumentation (1958) pour expliquer la structure d’une dissociation argumentative : l’illusion perceptive produite par la réfraction. Le choix d’un tel exemple peut surprendre dans la mesure où, dans les débats d’idées, les dissociations argumentatives sont bien plus souvent, du type opinion / vérité que du type apparence (ou perception) / réalité. L’intuition de Perelman et Olbrechts-Tyteca pourrait cependant correspondre à une tendance propre au vocabulaire utilisé en argumentation. En effet, selon Turco et Coltier (1988), certains marqueurs argumentatifs, ne correspondant pas à des réalités concrètes, ont été empruntés au vocabulaire, plus tangible, de l’espace et du temps (par exemple, or, alors, dès lors, pour le temps ou d’un côté, d’un autre côté, pour l’espace). L’hypothèse de travail consiste à reprendre cette proposition pour identifier quelles structures utiles à la description d’une illusion perceptuelle concrète peuvent être employées pour marquer la présence d’une dissociation argumentative. Il s’agit également de se demander quelles adaptations permettent éventuellement de distinguer un emploi descriptif (description d’une illusion perceptive) et un emploi argumentatif (marquage d’une dissociation argumentative). Par exemple, avec le verbe sembler, les descriptions d’illusions ne spécifieront habituellement pas de datif car l’illusion est généralement perçue par tout individu mis en situation d’observer un tel phénomène (Vue de loin, une tour carrée semblera ronde) ; dans une dissociation argumentative, et à rebours des emplois dits de mitigation, l’emploi prototypique consistera plutôt à utiliser une troisième personne de manière à désigner l’auteur d’une opinion adverse, une personne nettement distincte de celle du locuteur (Il lui/leur semble que p. Or, q). L’étude de la description des illusions perceptives se fonde sur un ouvrage de Jacques Ninnio (La science des illusions, 1998) qui est confrontée à un corpus de textes argumentatifs destinés à des élèves de terminale
The ATP-mediated formation of the YgjD–YeaZ–YjeE complex is required for the biosynthesis of tRNA t6A in Escherichia coli
No full textThe essential and universal N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) modification at position 37 of ANN-decoding tRNAs plays a pivotal role in translational fidelity through en-hancement of the cognate codon recognition and stabilization of the codon–anticodon interac-tion. In Escherichia coli, the YgjD (TsaD), YeaZ (TsaB), YjeE (TsaE) and YrdC (TsaC) proteins are necessary and sufficient for the in vitro biosyn-thesis of t6A, using tRNA, ATP, L-threonine and bicarbonate as substrates. YrdC synthesizes the short-lived L-threonylcarbamoyladenylate (TCA), and YgjD, YeaZ and YjeE cooperate to transfer the L-threonylcarbamoyl-moiety from TCA onto adenosine at position 37 of substrate tRNA. We determined the crystal structure of the heterodimer YgjD–YeaZ at 2.3 Å, revealing the presence of an unexpected molecule of ADP bound at an atypical site situated at the YgjD–YeaZ interface. We further showed that the ATPase activity of YjeE is strongly activated by the YgjD–YeaZ heterodimer. We established by binding experiments and SAXS data analysis that YgjD–YeaZ and YjeE form a compact ternary complex only in presence of ATP. The formation of the ternary YgjD–YeaZ–YjeE complex is required for the in vitro biosynthesis of t6A but not its ATPase activity
509, avenue des Noyers : Provence-Alpes-Côte d'Azur, Bouches-du-Rhône, Bouc-Bel-Air : rapport de diagnostic
No full text509, avenue des Noyers : Provence-Alpes-Côte d'Azur, Bouches-du-Rhône, Bouc-Bel-Air : rapport de diagnostic
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