1,721,021 research outputs found
Bioanalytische Untersuchungen der Wirkungen von chemischen Substanzen auf die Atmungskette von Candida albicans mit besonderem Augenmerk auf elektrochemische Methoden
Full text linkCandida albicans is the most prevalent human fungal pathogen. This fungus colonizes mucosa and skin in approximately 50% of healthy individuals. However, C. albicans causes opportunistic infections that range from superficial to systemic infection. Thus, new antifungal agents are urgently needed. The respiratory chain plays a role in processes such as oxidative phosphorylation, aerobic metabolism, and in the expression of virulence factors of C. albicans. Hence, the respiratory chain can be a potential drug target. The electron transport chain of C. albicans comprises three respiratory pathways, namely the classical, alternative oxidative and parallel pathway. In order to evaluate the respiratory chain status, the complexity of this structure necessities sensitive and mechanistic assays.
The work presented in this study demonstrates the use of biochemical and electrochemical assays to investigate these respiratory pathways. By applying biochemical methods, the activity of the respiratory chain and the impacts of specific complexes were elucidated. For example, growth inhibition tests showed the importance of the inhibited complexes for growth in different media. Disruption of the respiratory pathway at defined points, e.g. by rotenone, increased the rate of oxygen uptake. Respiratory deficiency increased the sensitivity of C. albicans to oxidative stress induced by complex I and III inhibitors. Analysis of metabolites exhibited the role of the fermentation pathway in the cell survival.
Two electrochemical approaches were applied in this study:
(a) A self-mediated electron transfer approach was utilized to investigate the classical respiratory chain. By this technique the effect of complex IV inhibitors on the respiratory activity can be easily detected.
(b) DCIP-mediated electron transfer approach was used to evaluate the activity of NADH-dehyrogenase (mitochondrial complex I). Moreover, this system can be used to discriminate between the different Candida strains.C. albicans ist der häufigste humanpathogene Pilz. Er besiedelt die Haut und Schleimhäute von ungefähr 50% aller gesunden Individuen. Andererseits löst C. albicans bei Störungen des Immunsystems Infektionen aus, die oberflächlich oder systemisch sein können. Daher werden neue Antimykotika dringend gebraucht. Die Elektronentransportkette nimmt eine Schlüsselposition in Prozessen wie der oxidativen Phosphorylierung, dem aeroben Stoffwechsel und der Expression von Virulenzfaktoren von C. albicans ein. Daher kann die Atmungskette ein potenzielles Ziel für Wirkstoffe sein. Die Elektronentransportkette umfasst drei Wege, den klassischen, den alternativen oxidativen und den parallelen Weg. Um den Zustand der Atmungskette zu bewerten, sind aufgrund der Komplexizität dieser Struktur empfindliche und mechanistische Untersuchungen notwendig.
In dieser Arbeit wurde der Nutzen biochemischer und elektrochemischer Untersuchungsmethoden für diese Atmungswege demonstriert. Durch die Anwendung biochemischer Methoden wurden die Aktivität der Atmungskette und die Bedeutung spezifischer Komplexe beleuchtet. Zum Beispiel zeigten Untersuchungen zur Wachstumshemmung die Bedeutung der gehemmten Komplexe für das Wachstum in verschiedenen Medien. An definierten Punkten führten Unterbrechungen der Atmungskette, z. B. durch Rotenone, zu einer Steigerung der Sauerstoffaufnahme. Atmungsdefekte erhöhten die Empfindlichkeit von C. albicans für oxidativen Stress, der durch Inhibitoren von Komplex I und III induziert wurde. Die Analyse von Metaboliten durch die Bestimmung der Gärung im Überleben der Zellen heraus.
Zwei elektrochemische Ansätze wurden in dieser Arbeit verfolgt:
a) Ein Ansatz über selbst-vermittelten Elektronentransfer wurde benutzt um die klassische Atmungskette zu untersuchen. Durch diese Methode kann die Wirkung von Inhibitoren von Komplex IV auf die Atmungsaktivität einfach detektiert werden.
b) Ein Ansatz mit DCIP-vermitteltem Elektronentransfer wurde verwendet um speziell die Aktivität des NADH-Dehydrogenase-Komplex I zu untersuchen
Diagnostischer Wert und Regulation von ausgewählten Candida albicans Zelloberflächen Proteinen
Full text linkThe aim of the thesis was to identify cell surface proteins of Candida albicans which could be used for diagnostic purposes. Additionally, regulatory pathways, which govern the expression of such cell surface proteins involved in iron uptake, were studied. We applied different methods of cell surface protein extraction and selected Bgl2p as first target protein. Based on sequence homologies and a modeled structure of Bgl2p, we identified a unique 14 aa peptide from Bgl2p, which was used for immunization. Different supernatants of hybridoma cell cultures, containing monoclonal antibodies directed against this peptide, could bind a recombinant version of purified Bgl2p. Two of these monoclonal antibodies could bind to whole C. albicans cells. Thus, these antibodies are promising tools for diagnosis of C. albicans infections. Multicopper ferroxidase (MCFO) proteins are cell surface components of the reductive iron uptake pathway (RIUP) and were isolated by heat extraction. MCFOs expression was regulated by iron availability as well as by the high osmolarity glycerol (HOG) pathway. We studied the response of C. albicans to different iron concentrations. We show that Hog1p of C. albicans is involved in the response to changes in extracellular iron concentrations. Hog1p has thus a dual role in C. albicans iron homeostasis: basal Hog1p activity repressed high affinity iron uptake components independently of iron availability, and hyper-activity of Hog1p led to the activation of a specific response to high iron concentrations. The HOG activating antifungal fludioxonil repressed RIUP components even under iron restricted conditions in addition to decreasing growth of C. albicans during iron restriction. Interestingly, the fludioxonil mediated repression of RIUP components was independent of the HOG pathway, as well as of the negative regulator of iron uptake proteins Sfu1p. This indicates the existence of a complex regulatory network for iron uptake proteins.Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Zelloberflächenproteinen aus Candida albicans, welche in der Diagnostik verwendet werden könnten. Regulatorische Mechanismen, welche die Expression von solchen Proteinen (insbesondere Eisenaufnahmeproteinen) kontrollieren, wurden untersucht. Wir haben verschiedene Methoden für die Isolierung von Zelloberflächenproteinen angewendet und wählten Bgl2p als erstes Zielprotein für C. albicans Diagnostik. Anhand von Sequenzhomologien sowie eines Proteinstruktur-Modells, wurde ein für Bgl2p spezifisches 14 Aminosäuren langes Peptid identifiziert. Monoklonale Antikörper gegen dieses Peptid wurden von Projektpartnern hergestellt. Mehrere solcher Antikörper, die aus Überständen von Hybridomazelllinien-Kulturen stammten, konnten eine rekombinante, aufgereinigte Version des Bgl2p binden. Zwei Antikörper konnten auch an C. albicans Zellen binden und sind somit vielversprechend für die diagnostische Erkennung dieses Pilzes. Eisenaufnahmeproteine aus der Multi-Copper-Ferroxidasen Klasse wurden durch Hitzeextraktion isoliert. Die Expression dieser Proteine war durch Eisenverfügbarkeit sowie durch die Hog1p Kinase reguliert. Wir konnten zeigen, dass Hog1p an der Antwort von C. albicans auf veränderte Eisenkonzentrationen im extrazellulären Milieu beteiligt ist. Hog1p spielt somit eine Doppelrolle in der Eisen-Homöostase von C. albicans: Die basale Hog1p Aktivität reprimiert die Expression von Eisenaufnahmeproteinen unabhängig von der Eisenverfügbarkeit, während die Hyper-Aktivität von Hog1p eine spezifische Antwort auf hohe Eisenkonzentrationen aktiviert. Das Hog1p-aktivierende Antimykotikum Fludioxonil (Fdx) reprimierte Komponenten des reduktiven Eisenaufnahmewegs und verursachte leichte Wachstumsdefekte von C. albicans unter Eisenmangelbedingungen. Die Repression solcher Komponenten durch Fdx war weder von Hog1p, noch vom negativen Regulator der Eisenaufnahme Sfu1p abhängig, was auf eine komplexe Regulation der Eisenaufnahme hindeutet
Search for compounds against Candida albicans: establishment of novel screenings and investigation of antimycotic substances
No full textCandida albicans ist ein Bestandteil der kommensalen Mikroflora der meisten gesunden Individuen. Allerdings kann sie bei Störungen des Immunsystems Infektionen auslösen, die besonders für intensivmedizinischen Patienten tödlich sein können. Daher besteht ein andauerndes Interesse an neuen Wirkstoffen gegen C. albicans.
Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer Testsysteme, mit deren Hilfe eine große Anzahl von Verbindungen auf eine antimykotische Wirkung untersucht werden können. Um Verbindungen zu finden, welche die Infektionsfähigkeit von C. albicans schwächen, wurden diese Screenings unter Bedingungen durchgeführt, die Aspekte der Infektionssituation simulierten. Wachstumsbasierte Tests wurden während der Kultivierung auf alternativen Stickstoff- und Kohlenstoffquellen durchgeführt, die C. albicans metabolisieren können muss, um vollvirulent zu sein. Ein Screening wurde etabliert, in dem die Histidinkinase CaNik1p, ebenfalls ein Virulenzfaktor, in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurde. In diesem System bewirkten Histidinkinaseinhibitoren eine Wachstumshemmung. Mit Hilfe eines C. albicans-Reporterstammes konnte außerdem ein Test etabliert werden, mit dem Verbindungen identifiziert werden können, die den morphologischen Wandel von der Hefen- zur Hyphenform unterbinden.
Die Screenings wurden an einer synthetischen Substanzsammlung von EMC microcollections GmbH, Tübingen, ausprobiert. Es wurden 32 Verbindungen mit antimykotischen Wirkung gefunden, von denen zwei in den untersuchten Konzentrationen keine zytotoxische Wirkung auf humane A-549-Zellen hatten.
Ein weiteres Ziel war die Etablierung von C. albicans-Ganzgenom-Microarrays um die Wirkung von verschiedenen Kulturbedingungen und antimykotischen Verbindungen auf das Transkriptom von C. albicans zu untersuchen. Mit deren Hilfe wurden die in den Screenings verwendeten Wachstumsbedingungen, sowie die Wirkung des Atmungsketteninhibitors Myxothiazol und des Histidinkinaseinhibitors Fludioxonil charakterisiert.Candida albicans is part of the normal commensal microflora of healthy individuals. However, if the immune system is compromised, it can cause local and systemic infections which can even lead to the death of patients in intensive care.
Substances from a number of classes are available for treatment of these infections, but due to the risk of emerging resistances as well as serious side effects, there is a continuing interest in the study of novel compounds against C. albicans.
One aim of this thesis was to establish new test systems which could be used to screen large numbers of compounds for antimycotic activity. In order to find compounds capable of attenuating infections, the sceenings were carried out at conditions simulating aspects of the infection. Growth-based assays were executed using alternative carbon or nitrogen sources, which C. albicans must be able to metabolise in order to achieve full virulence. In addition, a screening system was established in which a known virulence factor, the histidine kinase CaNik1p, was expressed in Saccharomyces cerevisiae. The inhibition of the histidine kinase lead to a strong growth inhibition in this model-system. Furthermore, a test using a C. albicans reporter-strain was established to detect compounds which interfere with the induction of
the morphological switch from yeast to hyphae.
These screenings were applied to a collection of synthetic compounds supplied by EMC microcollections GmbH, Tübingen, and 32 substances with an antimycotic activity were identified. Two of these substances displayed no cytotoxicity against
human A-549 cells.
Another aim was to establish the use of C. albicans whole-genome microarrays to characterize the effect of culture conditions and treatment with antimycotic compounds. They could be employed to study the growth conditions used in the screenings and the impact of the respiratory chain inhibitor myxothiazol and the histidine kinase inhibitor fludioxonil on the transcriptome of C. albicans
An object-oriented database for the compilation of signal transduction pathways
Full text linkTranspath ist ein Informationssystem fuer Signaltransduktionsnetze. Der Fokus liegt auf Signalpfaden und -kaskaden, die an der Regulation von Transkriptionsfaktoren beteiligt sind. Molekuele und Reaktionenen werden als Knoten in einem Signalgraphen aufgefasst und, zusammen mit Informationen ueber ihre Lokalisation, Qualitaet, Familienhierarchien und Signalmotive, in einer objekt-orientierten Databank gespeichert. Weiterhin werden Verweise zu anderen Datenbanken und der Originalliteratur gespeichert. Transpath unterscheidet zwischen den Zuständen eines Signalmoleküles und kann die Reaktionsmechanismen der Signalinteraktionen angemessen beschreiben. Transpath is über das World Wide Web (http://transpath.gbf.de) verfügbar durch ein Servlet-basiertes Interface, das dynamische Sichten direkt aus dem Inhalt der Datenbank erzeugt. Signalpfad-Abfragen und verschiedene Arten der Visualisierung werden zusammen mit textbasierenden Abfragen und Detailinformationen zu einzelnen Eintraegen unterstuetzt. Es wird gezeigt dass die Datenbank zur Analyse des Signalnetzes von Nutzen ist und die Grundlage fuer Simulationen liefern kann.Transpath is an information system on signal-transduction networks. It focuses on pathways involved in the regulation of transcription factors. Molecules and reactions are the nodes in a signaling graph. They are stored in an object-oriented database, together with information about their location, quality, family relationships and signaling motifs. Also stored are links to other databases and references to the original literature. Transpath differentiates between the states of a signal molecule, and can adequately describe the reaction mechanisms of signaling interactions. It is available over the web (http://transpath.gbf.de) through a Servlet-based interface, that creates dynamic content directly from the contents of the database. Pathway query mechanisms and several kinds of display are provided for the database in addition to text-based queries and information on single entries. We show that the database is useful for analysis of the signaling network and can provide the basis for simulations
Action of Natural Products on functions of the macrophage cell line RAW 264.7
Full text linkDie Untersuchung von Naturstoffen beschränkte sich in der Vergangenheit auf die Suche nach neuen Antibiotika und neuen Fungiziden sowie der Entdeckung von möglichen Krebstherapeutika. Die Wirkung auf das Immunsystem eines Organismus war dabei in der Regel nicht Schwerpunkt einer Untersuchung. In dieser Arbeit wurden Makrophagen als Zielzellen für Naturstoffe verwendet um zu testen ob diese Subtanzen, neben ihren bekannten Wirkungen, einen Einfluss auf die Funktionen der Makrophagen besitzen. Über die Wirkung der verwendeten Naturstoffe war zu Beginn der Arbeit lediglich bekannt, dass sie auf das Cytoskelett von eukaryotischen Zellen wirken, indem sie die Mikrotubuli stabilisieren bzw. destabilisieren (mit Ausnahme des Vioprolids, dessen Target bislang unbekannt ist), und dass sie gegenüber den eukaryotischen Zellen eine hohe Toxizität aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse der Naturstoffe Epothilon B, Disorazol A, Tubulysin A und Vioprolid A auf verschiedene Funktionen der Makrophagenzelllinie RAW 264.7, als Vertreter des Immunsystems, getestet. Dabei wurde die Bildung von Stickstoffmonoxid, der Cytokine Interleukin 6 und TNF-alpha und die Bestimmung der Phagozytoseaktivität der Makrophagen als zentraler Untersuchungsschwerpunkt gewählt. Es zeigte sich, dass die Naturstoffe, mit Ausnahme des Tubulysins, keinen steigernden Effekt auf die Funktionen der Zellen besitzen.The analysis of natural products has recently been limited to the search for new antibiotics and new fungicides, as well as the discovery of potential anti-cancer agents. The effect on the immune system of an organism has usually not been the main focus of the investigations. In this work, macrophages were used as target cells for natural compounds in order to test whether these substances had - besides the known – any effects on the functions of the macrophages’ action. At the beginning of the work, the compounds were known for their effect on the cytoskeleton of eukaryotic cells by stabilizing or destabilizing the microtubules (except for Vioprolide, whose target is still unknown), and their high toxicity against eukaryotic cells. The actions of the natural products Epothilone B, Disorazol A, Tubulysin A and Vioprolide A on different functions of the macrophage cell line RAW264.7 as exponent for the immune system were tested in the present work. The production of nitric oxide, the cytokines Interleukin 6 and TNF-alpha, and the determination of the phagocytotic activity of the macrophages were picked as the main focus of this study. It was shown that the natural products, except for Tubulysin, have no effect on the functions of the cells
Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid-Analytik in der Bioprozeßüberwachung
Full text linkIn der vorliegenden Arbeit wurden alternative Methoden zur bisher in der Bioprozeß-überwachung eingesetzten HPLC-Nukleotidanalytik entwickelt, so daß mit Hilfe von enzymatischen und elektrophoretischen Prinzipien eine on-line Überwachung über die Bestimmung relevanter Einzelparameter unter einer deutlichen Verkürzung der Analysendauer möglich wurde. Die Untersuchungen wurden anhand von zwei Analyten durchgeführt: zum einen wurde Xanthin ausgewählt, das eine direkte Kopplung mit dem Zellwachstum aufwies und zudem extrazellulär im Medium vorlag, und zum anderen Adenosintriphosphat (ATP) als intrazelluläre Komponente, das zwar nur indirekt über den Adenylate Energy Charge Wechselwirkungen mit dem Wachstumsverhalten zeigte, aber eines der wichtigsten Nukleotide darstellt. Die Basis zur Entwicklung geeigneter Detektionssysteme bildeten zunächst amperometrische Biosensoren. Zum Nachweis von ATP wurde das Enzympaar Hexokinase/Glucose-Oxidase gewählt, das auf verschiedene Trägermaterialien co- oder separat immobilisiert wurde. Zur Bestimmung von Xanthin wurde die Reaktion der Xanthin-Oxidase ausgenutzt, die über Polymereinschluß-Verfahren direkt auf die Arbeitselektrode einer Dickschichtelektrode oder über Quervernetzung auf Glas-Beads gebunden wurde. Die resultierenden Biosensoren wurden anschließend hin-sichtlich ihrer Stabilität und Sensitivität in einem Fließsystem charakterisiert. Neben dem enzymatischen Assay wurde Xanthin auch über elektrophoretische Verfahren nachgewiesen, wobei hierfür sowohl ein kommerzielles Kapillarelektrophorese-Instrument als auch integrierte mikrofluide Strukturen (Lab-on-a-Chip) zum Einsatz kamen. Mit Hilfe der miniaturisierten Systeme konnte im Vergleich zum Makrosystem das erforderliche Probenvolumen und der Reagenzienverbrauch reduziert und die Analyendauer deutlich verkürzt werden.This work was focused on the development of alternative methods for HPLC-analysis of nucleotides in bioprocess monitoring to enable an on-line control by detecting relevant parameters and applying enzymatic and elektrophoretic principles leading also to decreasing analysis times. Two analytes were chosen for the following investigations: xanthine as an extracellular component showing a direct linkage to cell growth and adenosine triphosphate (ATP) as an intracellular substance which had only an indirect influence via the adenylate energy charge but belongs to one of the most important nucleotides. At first suitable detection systems were developed on the basis of amperometric biosensors. For ATP determination the enzyme couple hexokinase/glucose oxidase co- or separately immobilized on different supports was used. Xanthine detection based on the xanthine oxidase reaction. The enzyme was bound by a polymer inclusion procedure directly onto the working electrode of a thick film electrode or crosslinked via glutaraldehyde onto glass beads. The resulting biosensors were integrated into a flow injection system and characterized in regard to their stability and sensitivity. In addition xanthine was detected by applying electrophoretic separation techniques. A commercial capillary electrophoresis (CE) instrument and integrated microfluidic devices often described as lab-on-a-chip were used. In comparison with the macro-CE the sample requirement and reagent consumption could be reduced and shorter anaylsis times were obtained when xanthine separation was performed within a microsystem
Die zellulären und molekularen Eigenschaften von Genistein gegen C.albicans Infektionen
Full text linkGenistein is a well known natural compound which is present in soy foods and exerts many beneficial functions. However, until now little is known about the effects of genistein on C. albicans, the function of macrophages, and the interactions between both organisms. We found that genistein could influence RAW264.7 macrophage functions: genistein reduced the cell viability after 24 h and 48h, due to G2/M phase cell cycle arrest. Treatment of the macrophages with genistein for 24 or 48 h also led to significant morphological changes due to influence the F-actin cytoskeleton structure. After treatment of the macrophages with genistein, the phagocytotic efficiency for C. albicans was decreased in a time- and dose-dependent manner. Moreover, the production of cytokines (TNF-α, IL-10) stimulated by C. albicans was strongly inhibited. Genistein also blocked the activation of macrophages by LPS, i.e. the secretion of NO, TNF-α, and IL-10, which is related to the inhibition of the activation of transcription factors NF-κB and AP-1.
Additionally, genistein blocked oxygen consumption of C. albicans and induced the production of reactive oxygen species by targeting on the complex I of respiratory chain of C. albicans. Meanwhile, we found that genistein binds to complex I of C. albicans at a site different from that of rotenone.
Moreover, treatment of C. albicans with genistein enhanced the susceptibility of the pathogen for phagocytosis and increased the production of the cytokines IL-10 and TNF-α. However, genistein did not influence the structure of the cell wall glucans and mannans of the yeast, whereas the cell surface hydrophobicity increased.
In conclusion, genistein could influence both the functions of host macrophages and the properties of the pathogen C. albicans. Thus, genistein may have antimycotic effects by acting on C. albicans to enhance the phagocytic activity of macrophages.Genistein ist eine bekannte natürliche Verbindung, die in Soja-Lebensmitteln vorkommt und viele nützliche Funktionen ausübt. Bis jetzt ist nur wenig über die Auswirkungen von Genistein auf C. albicans, die Funktion von Makrophagen und die Wechselwirkungen zwischen beiden Organismen bekannt. Wir fanden, dass Genistein die Funktionen von RAW264.7 Makrophagen beeinflussen kann, z.B. führte die Behandlung zu einer Reduktion der Zellvitalität nach 24 h und 48h, aufgrund eines G2 / M Phase Zellzyklusarrest. Die behandelten Makrophagen (24 oder 48 h) zeigten erhebliche morphologische Veränderungen der F-Aktin-Struktur sowie eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der Phagozytose Effizienz gegenüber C. albicans. Darüber hinaus wurde die Produktion von Zytokinen (TNF-α, IL-10) nach Infektion stark gehemmt. Genistein blockierte ebenfalls die Aktivierung der Makrophagen durch LPS, was zu einer verminderten Sekretion von NO, TNF-α und IL-10, durch Inhibierung der Transkriptionsfaktoren NF-B und AP-1 führt.
Darüber hinaus beeinflusste Genistein den Sauerstoffverbrauch von C. albicans und induzierte die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch Interaktion mit Komplex I der Atmungskette von C. albicans. Mittlerweile haben wir festgestellt, dass sich die Bindestellen des Genistein von der des Rotenon unterscheiden.
Außerdem verstärkt eine Behandlung von C. albicans mit Genistein die Anfälligkeit der Erreger für die Phagozytose und erhöht die Zytokinproduktion (IL-10 und TNF-α). Genistein hat keinen Einfluss auf die Glukan- und Mannanstruktur der Hefe- Zellwand, erhöht jedoch die Hydrophobie der Oberfläche.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Genistein sowohl die Funktionen des Wirtes und als auch Eigenschaften des Erregers beeinflusst. Es besitzt antimykotische Wirkungen auf C. albicans und steigert gleichzeitig die Phagozytoseaktivität der Makrophagen
Nachweis von Nukleinsäure-Wechselwirkungen mit Hilfe optischer Biosensoren
Full text linkIn der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich optische Biosensoren eignen, um Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren nachweisen zu können. Dabei wurden der Gitterkoppler, ein integriert-optischer Detektor, sowie das BIAcore-System verwendet. Beide Detektoren nutzen ein sensitives, sog. evaneszentes Feld, um Anlagerungen von Molekülen auf der Sensoroberfläche zu verfolgen. Dieses elektromagnetische Feld wird bei beiden Geräten durch optische Anregung induziert. Wichtig für die Anwendung von Biosensoren ist eine möglichst hohe Dichte von 'Erkennungsmolekülen' auf der Sensoroberfläche. Deshalb wurden die Belegung zu Beginn mit Hilfe eines Atom-Kraftmikroskops (AFM) untersucht. Damit konnte die Dichte des immobilisierten Proteins Avidin charakterisiert sowie das Anlagerungsverhalten von DNA an verschieden modifizierten Oberflächen untersucht werden. Um Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuremolekülen mit Hilfe der optischen Biosensoren zu detektieren, wurde ein Reaktionspartner, ein kurzes Oligonukleotid ('Sonde'), chemisch oder vermittelt durch das Affinitätspaar Avidin-Biotin auf die Oberfläche immobilisiert. War aufgrund übereinstimmender Basenabfolge eine Doppelstrang-bildung ('Hybridisierung') zwischen der kurzen Sonde auf dem Sensor und einer Probe möglich, veränderte sich durch die Anlagerung der effektive Brechungsindex auf der Oberfläche. Diese Verschiebung konnte durch die optischen Biosensoren gemessen werden. Beide Sensoren wurden in Hinblick auf Konzentrations- und Längenabhängigkeit der Oligonukleotidprobe charakterisiert. Dabei zeigte sich eine niedrigere Nachweisgrenze beim BIAcore, die auf die unterschiedlichen Oberflächen der Sensoren zurückzuführen war. Anhand von zwei Applikationen wurde untersucht, ob die Biosensoren konventionelle Methoden der Molekularbiologie ergänzen bzw. ersetzen können. In der ersten Anwendung wurde versucht, ein bakterielles Plasmid anhand einer spezifischen Basenabfolge nachzuweisen. Es zeigteThis work is focused on the use of optical biosensors and their possible application to nucleic acid analysis. Therefore, the integrated optical grating coupler system and the BIAcore, a system based on surface plasmon resonance (SPR) were used. Both devices exploit a propagating electromagnetic field, which is induced by optical irradiation. Direct sensing of (bio-)chemical reactions is based on the change of the effective refractive index of a waveguide mode due to the adsorption of molecules to the surface of the sensor. Desirable for the application of biosensors is a high density of surface bound receptor molecules. To characterize the homogeneity of the surface coverage and orientation of the biomolecules, the atomic force microscope (AFM) was utilized. The investigations focused on the binding of the protein avidin and the adsorption of DNA to different modified surfaces. To investigate the hybridization of nucleic acid strands, a short oligonucleotide was bound to the sensor surface via covalent binding or via the affinity couple biotin-avidin. Hybridization was observable in real time depending on the sequence of the probe strand. Both optical biosensors mentioned above were characterized in terms of signal dependency of the concentration and length of the probe oligonucleotide. However, with respect to the different loading capacities of the sensor surfaces, the BIAcore system showed a lower detection limit compared to grating coupler experiments. Two different applications were chosen to investigate whether optical biosensors could complement or replace conventional methods in molecular biology: The first application demonstrated the specific detection of a bacterial plasmid. It was shown that the denatured plasmid resulted in no detectable signal. However, an amplified plasmid sequence produced by asymmetric polymerase chain reaction (PCR) could be hybridized easily to the sensor surface. The dependency between biosensor signal an
Kombinatorische Synthese von Bibliotheken niedermolekularer Verbindungen um das p-Benzochinon-Grundgerüst
Full text linkThe quinones based natural products are known to have various biological activities. This makes the 2-methoxycarbonyl-1,4-benzoquinone a suitable template for the synthesis of a small natural-product-based library for chemical genetics studies. The aim of this thesis was the development of an efficient synthetic route for the synthesis of p-benzoquinone library based on the Michael addition concept. Biological activity of the synthesized benzoquinone derivatives has been evaluated in cellular and microbiological assays. The next goal of this thesis was implementation of the Michael addition concept on solid phase. The first step for the synthesis occurs with the attachment of Boc protected nucleophiles as ether or ester to the Merrifield resin. In the next step, 2-methoxycarbonyl-1,4- benzoquinone is reacted through an addition reaction with the functionalised resin. Hydroquinone is formed as intermediate, which is then oxidized with DDQ to the corresponding benzoquinone. The resulted monosubstituted benzoquinone is the reacted through another addition reaction with the second nucleophile with formation after the case of the disubstituted intermediate. In the last step the resulted intermediate is protected by alkylation or acetylation. Finally the cleavage is achieved under acidic conditions (SnCl4) to the desired compound. Using this strategy the first attempts on the solid phase have been done.Die aus Chinon-Grundgerüst abgeleitete Naturstoffe sind für ihre zahlreichen biologischen Äktivitäten bekannt. Aus dem Grund stellt das 2-Methoxycarbonyl-1,4-benzochinon ein geeignetes Templat für die Synthese von Bibliotheken niedermolekularer Verbindungen für die chemisch genetischen Studien dar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines effizienten Synthesewegs für die Darstellung von p-Benzochinon-Bibliotheken unter Einbezug des Micheal-Addition- Konzeptes. Die biologische Aktivitäten der synthetisierten Benzoquinonederivate wurden anschliessend anhand der verschieden biologischen Assays evaluiert. Der nächster Schritt war die Implementierung des Michael-Addition Konzeptes an der Festphase. Im ersten Schritt der Synthese erfolgt die Addition von Boc-geschützten Nucleophilen als Ester bzw. Ether am Merrifield-Harz, welches dann in einem weiteren Schritt mit 2-Methoxycarbonyl-1,4-benzochinone weiter funktionalisiert wird. Das hiebei entstandene Hydrochinon wird mith DDQ zum Benzochinon oxidiert. Das resultierende monosubstituierte Benzochinon reagiert in einer weiteren Additionreaktion mit zweitem Nucleophilen unter Bildung vom disubstituerten Intermediat, welches anschliessend alkyliert bzw. aceteyliert wird. Zum Schluss wird das gebildete Produkt von der Festphase unter saurer Konditionen abgespalten. Mit dieser Strategie wurden die ersten Syntheseversuche an der Festphase durchgeführt
Aufklärung der Wirkmechanismen der Gephyronsäure und verwandter Verbindungen, die die eukaryotische Protein Synthese inhibieren
Full text linkProtein biosynthesis is a vital, tightly regulated and a complex process involving a number of factors and enzymes. While the bacterial protein synthesis machinery is well understood due to the availability of various small molecule inhibitors, this is not true for the eukaryotic translation system. It is therefore of great interest to study small molecule translation inhibitors and elucidate their mode of action. This study involves four small molecules which target the eukaryotic translation system, i) gephyronic acid A, ii) des-epoxy tedanolide, iii) myriaporone 3/4, and iv) aetheramide B.
All these compounds inhibit growth of human cancer cell lines like KB-3-1 and A-431 in nanomolar ranges. Their cytotoxicity is attributed to the translation inhibition properties. In vitro and in vivo inhibition assays showed that the four substances inhibited translation with IC50 values in the nanomolar range. Using bicistronic vectors the phase of translation inhibition was assessed. Gephyronic acid A and aetheramide B inhibited the initiation, myriaporone 3/4 the elongation. Des-epoxy tedanolide had targets in both phases. A Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) approach was used to identify the targets of gephyronic acid and myriaporone 3/4. The results showed that gephyronic acid and myriaporone bind directly to the eukaryotic initiation factor 2 alpha (eIF2α) and the eEF2 (eukaryotic elongation factor 2) kinase, respectively. In both cases they are the first natural compounds identified to target these factors. In silico modelling studies suggested that the important epoxide group of gephyronic acid binds to Tyr 39 and Glu 15. The binding of gephyronic acid to eIF2α probably inhibits eIF2α interaction with the guanidine exchange factor eIF2B required for conversion of eIF2α-GDP to eIF2α-GTP. Using immunofluorescence techniques on treated cells it was shown that des-epoxy tedanolide inhibited translation by inducing the phosphorylation of eIF2α and eEF2. Aetheramide B inhibited translation via dephosphorylation of 4E-BP, i.e. by inhibiting the mTOR pathway.Proteinbiosynthese ist ein zentraler, streng regulierter und komplexer Prozess, der eine Reihe von Faktoren und Enzymen einschließt. Während der bakterielle Proteinsynthese-Mechanismus gut verstanden ist, da verschiedene kleine Moleküle als Translationsinhibitoren zur Verfügung stehen, ist das für das eukaryontische Translationssystem nicht der Fall. Es ist deshalb von großem Interesse, niedermolekulare Translationsinhibitoren zu erforschen und ihre Wirkweise aufzuklären. Diese Studie befasst sich mit vier kleinen Molekülen, die mit dem eukaryontischen Translationssystem interagieren, Gephyronsäure A, Des-epoxy-Tedanolid, Myriaporon 3/4 und Aetheramid B.
Alle diese Verbindungen hemmen das Wachstum von humanen Krebszelllinien wie KB-3-1 und A 431 im nanomolaren Bereich. Ihre Zytotoxizität ist auf die Translations-hemmenden Eigenschaften zurückzuführen. Hemmtests in vitro und in vivo zeigten, dass die vier Substanzen die Translation mit IC50-Werten hemmen, die im nanomolaren Bereich liegen. Die Phase der Translationshemmung konnte mit Hilfe bicistronischer Vektoren bestimmt werden. Danach hemmen Gephyronsäure A und Aetheramid B die Initiation, Myriaporon 3/4 die Elongation. Des-epoxy-Tedanolid hat Zielproteine in beiden Phasen. Mit Hilfe eines Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Ansatzes konnten die Zielproteine von Gephyronsäure und Myriaporon 3/4 identifiziert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass Gephyronsäure und Myriaporon direkt am eukaryontischen Initiationsfaktor 2 alpha (eIF2α) bzw. an der eEF2(eukaryontischer Elongationsfaktor 2)-Kinase binden. In beiden Fällen sind es die ersten identifizierten Naturstoffe, die mit diesen Faktoren interagieren. Modellierungsstudien in silico legen nahe, dass die Bindungspartner der für die Wirkung wichtigen Epoxidgruppe der Gephyronsäure Tyr 39 and Glu 14 sind. Die Bindung von Gephyronsäure an eIF2α hemmt wahrscheinlich die Interaktion mit dem Guanidin-Austauschfaktor eIF2B, die für die Umwandlung von eIF2α-GDP zu eIF2α-GTP nötig ist. Mit Immunfluoreszenztechniken konnte an behandelten Zellen gezeigt werden, dass Des-epoxy-Tedanolid die Translation dadurch hemmt, dass es eine Phosphorylierung von eIF2α und eEF2 induziert. Aetheramid B wirkt über eine Dephosphorylierung von 4E-BP, d.h. über den mTOR-Signalweg
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