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I MICROARRAY PROTEICI: POSSIBILI SCENARI NELLA DIAGNOSTICA DELLE MICOSI INVASIVE
No full textI microarray proteici sono comunemente distinguibili in due tipi, uno dedicato a stabilire la presenza e la quantità di una
proteina o di un anticorpo specifico presenti in una determinata matrice biologica (“abundance-based microarrays”) e
l’altro a valutarne la funzione (“function-based microarrays”) (1). Per quanto attiene alla prima categoria, sono stati
descritti sistemi a cattura molto simili a quelli utilizzati nei saggi ELISA che prevedono l’immobilizzazione su un
supporto solido di molecole di cattura. Tali molecole possono essere anticorpi, soprattutto monoclonali, per la
rilevazione quali-quantitativa di analiti specifici, oppure antigeni purificati/ricombinati per la determinazione di
specifici titoli anticorpali. Ad oggi, questo tipo di microarray ha trovato un grosso impiego nel campo della proteomica,
nella ricerca di nuovi farmaci e nella identificazione di marcatori di malattia, principalmente nell’ambito delle infezioni
virali e dei tumori. Le caratteristiche dei saggi diagnostici su piattaforma microarray, quali l’elevata sensibilità, la
multiparametricità, la miniaturizzazione e la possibilità di automazione, hanno portato alla messa a punto di piattaforme
innovative, particolarmente utili anche per la loro duttilità. L’utilizzo dei microarray proteici in diagnostica ha portato
inoltre a riconsiderare la sierologia come strumento di indagine potenzialmente utile nella diagnosi di micosi
opportunistiche invasive e nella valutazione dell’efficacia di terapie antifungine. In un lavoro recentemente pubblicato,
è stato identificato un gruppo di 13 antigeni di Candida albicans che consente di discriminare pazienti con candidemia,
da soggetti sani o colonizzati; sempre gli stessi autori hanno descritto un altro gruppo di 33 antigeni, che permette di
distinguere sierologicamente pazienti in fase acuta di malattia da pazienti convalescenti (2). Dall’altra parte, nella
diagnosi di micosi primitive da patogeni quali Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis, in cui la sierologia
riveste un ruolo di primo piano, l’impiego del microarray proteico ha portato ad accorpare in un unico chip antigeni dei
diversi patogeni (3). In particolare, il saggio messo a punto consente di identificare simultaneamente soggetti positivi
per uno o più patogeni, sulla base dei livelli di IgM e/o IgG specifiche. Similmente, sono stati riconosciuti come
marcatori di polmonite gli alti livelli di anticorpi sierici verso la proteina Msg1 di Pneumocystis jirovecii (4), mentre la
comparsa di citochine proinfiammatorie e della proteina C-reattiva sono risultate preziosi marcatori sierologici precoci
di aspergillosi invasiva (5).
Nel complesso, visto l’incremento nel numero sia di micosi opportunistiche in soggetti particolarmente difficili sia di
micosi primitive (in passato inusuali, ora più frequenti dato l’aumento dei flussi turistici e migratori), i contributi forniti
dalle nuove tecnologie saranno fondamentali per comprendere meglio il quadro clinico associato alla micosi invasiva,
grazie ad un metodo diagnostico veloce e multiparametrico. Questo aspetto risulterà particolarmente interessante in
quanto consentirà di valutare contemporaneamente tipi diversi di parametri che includono non solo il patogeno ed i suoi
prodotti, ma anche l’ospite con la sua peculiare reattività antimicrobica, sia innata che adattativa.
(1) LaBaer and Ramachandran, Curr Opin Chem Biol, 2005
(2) Mochon et al., Plos Pathogens, 2010
(3) Ardizzoni et al., New Microbiol, 2011
(4) Djawe et al., Plos One, 2010
(5) Chai et al., J. Infect Dis, 201
NF-kB activation and p38 phosphorilation in microglial cells infected with Leptospira or exposed to partially purified leptospiral lipoproteins
No full textRecently, we have shown a differential susceptibility of non-pathogenic vs. pathogenic leptospires to phagocytosis and killing by microglial cells. Although all ingested to some extent, only the pathogenic strains survived intracellularly while the non-pathogenic ones were killed in a time-dependent manner. By the same infection model, here we demonstrate that microglial cells respond to Leptospira infection with a time- and dose-dependent induction of molecular signals (p38 phosphorilation and NF-kB activation) and the production of soluble factors (cytokines and nitric oxide). Such bio-molecular response is predominantly observed against the pathogenic Leptospira; the phenomenon is reproduced by leptospiral lipoproteins and, to a lower extent, by leptospiral-derived LPS. These data provide initial evidence that Leptospira affects microglial cell response in a different manner depending upon the virulence of the infecting strain; specific bacterial components happen to be involved in the induction of such pathogen-induced immune response
DETECTION OF ANTIGEN-SPECIFIC ANTIBODIES IN SERUM AND FOLLICULAR FLUIDS BY PROTEIN MICROARRAYS.
No full textBackground. Wide spectrum serological screening of women prior to or during pregnancy may greatly help in preventing vertically transmitted infections (VTI) and their severe consequences to the foetus/newborn. Protein microarrays, made up by spotting many antigens onto a restricted area of a microscope slide, allow to detect, in one shot, specific antibodies against a wide range of antigenic specificities.
Objectives. To detect, in paired serum and follicular fluid (FF) samples, antigen-specific antibodies against vertically transmitted pathogens by protein microarrays; to investigate the potential relation between antibody profiles and pregnancy outcome.
Methods. Serum and FF paired samples were collected from 102 women undergoing in vitro fertilization (IVF). Antigens, human antibodies and controls were spotted in an orderly manner by high speed robotics. Microarrays were processed with serum or FF and the occurred immunocomplexes were revealed by fluorescently-labelled secondary antibodies. The fluorescent signals were read by a laser scanner and quantified by a dedicated software.
Conclusions. Antigen-specific antibodies can be effectively detected in serum and FF by microarray. The presence or absence of certain antigen-specific antibodies is significantly related to clinical parameters such as the number of inseminated good quality oocytes or the number of successful embryo transfers. These results encourage protein microarrays employment for wide spectrum investigations in diagnosing VTI; in particular, the use of biological matrices other than serum may help addressing yet unravelled questions
I MICROARRAY PROTEICI: NUOVI STRUMENTI DI INDAGINE NELLA DIAGNOSTICA DELLE INFEZIONI DA PATOGENI DEL COMPLESSO TORCH.
No full textLo screening sierologico su larga scala, effettuato prima o durante la gravidanza, fornisce un mezzo efficace per prevenire le infezioni a trasmissione verticale (ITV) e le loro gravi conseguenze per il prodotto del concepimento. Utilizzando un microarray proteico da noi messo a punto (1), abbiamo voluto determinare i livelli di anticorpi antigene-specifici nei confronti di patogeni a trasmissione verticale nel siero, nei liquidi follicolari (LF) e nei liquidi amniotici (LA) di pazienti gravide sottoposte a IVF, al fine di correlare profili anticorpali specifici con l’esito della gravidanza.
Sieri e LF sono stati prelevati da 102 pazienti sottoposte a trattamenti di procreazione medicalmente assistita. LA sono stati ottenuti da 100 pazienti di cui 50 con parto pretermine e 50 con parto a termine. I microarray, allestiti con antigeni, anticorpi e controlli di segnale, come precedentemente descritto (1), sono stati processati con siero, LF o LA e la formazione degli immunocomplessi è stata rivelata mediante anticorpi secondari marcati in fluorescenza. I segnali sono stati letti con uno scanner contenente laser a differenti lunghezze d’onda e successivamente quantificati ed analizzati da un software dedicato. Il saggio ha consentito di rivelare in maniera efficace IgG antigene-specifiche in tutte le matrici saggiate, mentre anticorpi IgM sono stati rilevati solamente nel siero. In particolare, la presenza o assenza di determinati anticorpi IgG nelle coppie di campioni siero/LF provenienti dalla stessa paziente è risultata significativamente correlata a parametri clinici, quali il numero di oociti inseminati di buona qualità o il numero di trasferimenti embrionali avvenuti con successo (2). L’analisi dei profili anticorpali sui LA nel secondo gruppo di 100 pazienti è tuttora in corso. Su questo gruppo di pazienti, inoltre, si sta impiegando un microarray commerciale per valutare la presenza di citochine e/o chemochine da correlare eventualmente con il quadro clinico della paziente e con l’esito della gravidanza (parto a termine o pretermine). Risultati preliminari hanno consentito di dimostrare l’efficacia dell’approccio, evidenziando la presenza di livelli significativi di alcune citochine nei fluidi amniotici. Sono in corso indagini per determinare il contenuto di citochine in tutti i LA oggetto di studio.
I dati finora ottenuti sostengono fortemente l’utilizzo del microarray proteico in indagini ad ampio spettro nella diagnosi di ITV; inoltre, l’utilizzo di matrici biologiche differenti dal siero può fornire un valido contributo per la risoluzione di quesiti diagnostici ancora irrisolti.
(1) Ardizzoni et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009.
(2) Ardizzoni et al., J Reprod Immunol, 2011
VALUTAZIONE DEI PROFILI IgG E IgM NEI CONFRONTI DI PATOGENI A TRASMISSIONE VERTICALE IN DIVERSE MATRICI BIOLOGICHE MEDIANTE MICROARRAY PROTEICO
No full textLo screening sierologico su larga scala, effettuato prima o durante la gravidanza, fornisce un mezzo efficace per prevenire infezioni a trasmissione verticale (ITV) e le loro gravi conseguenze per il prodotto del concepimento. Utilizzando un microarray proteico da noi messo a punto (1), abbiamo voluto determinare i livelli di anticorpi antigene-specifici nei confronti di patogeni a trasmissione verticale nel siero, nei fluidi follicolari (FF) e nei fluidi amniotici (FA) di pazienti gravide, al fine di correlare profili anticorpali specifici con l’esito della gravidanza.
Siero e FF sono stati prelevati da 102 pazienti sottoposte a trattamenti di procreazione medicalmente assistita. FA sono stati ottenuti da 100 pazienti di cui 50 con parto pretermine e 50 con gravidanza a termine. I microarray, allestiti con antigeni, anticorpi e controlli di segnale, come precedentemente descritto (1) sono stati processati con siero, FF o FA e la formazione degli immunocomplessi è stata rivelata mediante anticorpi secondari marcati in fluorescenza. I segnali sono stati letti con uno scanner contenente laser a differente lunghezza d’onda e successivamente quantificati ed analizzati da un software dedicato. Il saggio ha consentito di rivelare in maniera efficace anticorpi antigene-specifici in tutte le matrici saggiate. In particolare, la presenza o assenza di determinati anticorpi nelle coppie di campioni siero/FF provenienti dalla stessa paziente è risultata significativamente correlata a determinati parametri clinici, quali il numero di oociti inseminati di buona qualità o il numero di trasferimenti embrionali avvenuti con successo. L’analisi dei profili anticorpali sui FA del secondo gruppo di 100 pazienti è tuttora in corso.
I dati ottenuti incoraggiano l’utilizzo del microarray proteico per indagini ad ampio spettro nella diagnosi di ITV; inoltre, l’utilizzo di matrici biologiche differenti dal siero può fornire un valido contributo per la risoluzione di problemi ancora aperti.
(1) Ardizzoni et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009
IL MYCOARRAY: UN TEST RAPIDO PER LA DIAGNOSI SIEROLOGICA DI MICOSI ENDEMICHE
No full textIntroduzione
Le micosi da funghi dimorfi, estremamente rare in Europa, sono rappresentate da casi di importazione, con
l’eccezione della istoplasmosi per la quale sono stati segnalati anche casi autoctoni. La bassa frequenza, in
combinazione con l’aspecificità delle manifestazioni cliniche, rende difficile una diagnosi rapida. Scopo del
presente studio è la valutazione dell’utilizzo del saggio mycoarray (1) come strumento multiparametrico e rapido, a
supporto della sierologia convenzionale, nella diagnosi di laboratorio delle micosi endemiche.
Metodi
Antigeni fungini (H. capsulatum, C. immitis, B. dermatitidis e P. brasiliensis), diluizioni scalari di anticorpi IgG e
IgM e controlli sono stati deposti su vetrini microarray per mezzo di un sistema robotizzato ad alta precisione. I
vetrini così ottenuti sono stati cimentati col siero, opportunamente diluito, e successivamente con anticorpi
secondari marcati con fluorofori per rivelare l’avvenuta formazione degli immunocomplessi. Il segnale è stato
acquisito mediante uno scanner, quantificato ed analizzato per mezzo di un apposito software.
Risultati
Il mycoarray ha mostrato elevate sensibilità e specificità: un primo studio retrospettivo, condotto su sieri da
pazienti con diagnosi certa di istoplasmosi o di coccidioidomicosi, ha fornito risultati consistenti con i dati clinici e
di laboratorio, acquisiti con la diagnostica di routine. Indagini su ulteriori campioni da casi clinici “sospetti”,
analizzati con il mycoarray, hanno fornito risultati originali utili per la diagnosi definitiva di micosi endemica.
Conclusioni
Il mycoarray presenta una serie di peculiarità (miniaturizzazione, multiparametricità e rapidità di esecuzione) che lo
rendono estremamente utile come strumento di laboratorio a sussidio del percorso convenzionale nella diagnosi di
micosi primitive, specialmente in zone a bassa endemicità.
Ringraziamenti
Lavoro in parte supportato da MIUR, PRIN-200985J87J
Bibliografia
(1) Ardizzoni et al., (2011) New Microbiol, 34:307-16
IL MICROARRAY PROTEICO NELL’ANALISI DEI LIQUIDI AMNIOTICI: RICERCA DI MARKER PRECOCI DI INFIAMMAZIONE E/O INFEZIONE CORRELABILI AL PARTO PRETERMINE
No full text40° Congresso della SIM, Riccione 7-10 ottobre, 201
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