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Determinazione di ROS ed 8-OSSI-dg in linfociti sottoposti a danno ossidativo da metalli
No full textOBIETTIVI: - Nostri precedenti studi, effettuati in vitro su A549, linea
continua di pneumoniti, hanno rilevato un marcato effetto genotossico
da esposizione alla componente metallica adsorbita alle polveri
fini. Poiché la tossicità varia sensibilmente tra cellule normali e immortalizzate
abbiamo voluto valutare su linfociti, mediante indagine ex
vivo, gli effetti biologici di questo diffuso inquinante atmosferico. Il
biodosimetro utilizzato ha consentito inoltre di verificare la variabilità
individuale nel campione di popolazione saggiato.
MATERIALI E METODI: - I linfociti, isolati da 13 soggetti(età
35.6¡À11.8),venivano messi in coltura e, quindi, trattati in 3 giornatecon una soluzione costituita da V, Fe e Ni(68.8, 110.5 e 9.4 ¦ÌM
rispettivamente),ampiamente presenti nelle aree urbane. Mediante
tecniche citoflurimetriche, previo utilizzo di specifici fluorocromi, venivano
valutate la citotossicità, il livello citoplasmatico di ROS e quello
di8-ossi-dG, marcatore di danno ossidativo del DNA.
RISULTATI: - Contro una mortalità media pari a 8.9%(CV% 59.5) nei
controlli, quella osservata dopo trattamento raggiungeva il 17.8
%(p<0.01) con valori anche superiori al 30%in due dei campioni
esaminati. Maggiore era la variabilità osservata nei livelli di emissione
della DCF-DA, utilizzata per la determinazione dei ROS, sia nei controlli
(12.3 ¡À9.4) che nei trattati (20.7¡À15.6) Con ¦% compresi tra 2.1
e 281.9significative erano le differenzeK/trattati(p<0.01).L’analisi
dell’8-ossi-dG, effettuata mediante uso di avidina, ad elevata affinità
per la purina ossidata e marcata con fluoresceina
isotiocianato(Avidina-FITC), ha mostrato un incremento medio dopo
trattamento pari a 208.5% (p<0.01) con valori compresi tra 51.2 e
346.0(CV% 63.5).
CONCLUSIONI: - I significativi effetti osservati, riconducibili alla capacità
dei metalli di transizione di catalizzare la produzione di specie
radicaliche, confermano il rischio potenziale di questa componente
delle polveri fini per la salute pubblica. Infatti, malgrado l’effetto citotossico,
in tutti i campioni saggiati significativo era il livello di ossidazione
a carico del DNA delle cellule superstiti con possibili implicazioni
nel processo di cancerogenes
Fattori comportamentali e biologici nella suscettibilità individuale al danno ossidativo da xenobiotici
No full textOBIETTIVI: Recentemente è stata evidenziata l’importanza dei
polimorfismi genetici sul rischio genotossico da esposizione a
xenobiotici. Poiché anche variabili biologiche e comportamentali
giocano un ruolo nella suscettibilità individuale al cancro, in questo
studio è stato valutato il loro effetto sul danno ossidativo da
esposizione a oil fly ash(OFA) in colture linfocitarie di un campione
di popolazione di 47 individui(età 34.6±11.4) di cui 17(36.2%) maschi.
MATERIALI E METODI: Su aliquote di linfociti di ciascun soggetto,
previo isolamento e messa in coltura secondo i protocolli standard,
veniva determinato mediante Halo-Comet (1) il danno a carico del
DNA sia basale che dopo contatto overnight con un estratto acquoso
del campione ambientale a composizione nota. Ancora, per verificare
la capacità dei sistemi enzimatici di riparazione l’analisi veniva
eseguita anche dopo reincubazione per 6h in RPMI fresco.
RISULTATI: Gli esperimenti hanno rilevato nei linfociti trattati con il
campione ambientale differenze significative (Mann-Whitney p<0.05)
del nuclear spreading factor(NSF) in funzione del genere con valori
medi maggiori nei maschi(1.50±0.79 vs1.09±0.47). Differenze
significative erano anche osservate in funzione dell’abitudine a fumo
e, soprattutto, del regime alimentare. Infatti, nei fumatori si osservava
una riduzione (p=0.017) della capacità di riparazione con NSF a 6h
dal trattamento ancora ~doppi rispetto ai non fumatori. Anche il
consumo di carne esercitava un effetto negativo sulla capacità di
riparazione con valori di NSF del 78% superiori in chi la consumava
più di 3 volte/settimana (p<0.001). La capacità di riparazione era
invece maggiore (p=0.039) nei consumatori moderati di alcol ed in
chi consumava almeno 2 volte al giorno frutta e verdura(p=0.047).
In questi ultimi, inoltre, si osservava un danno del DNA minore in
seguito al trattamento con lo xenobiotico(p<0.05).
CONCLUSIONI: I risultati confermano l’importanza dello stile di vita
sulla suscettibilità al danno genotossico da esposizione passiva a
xenobiotici
In vitro assessment of mitochondrial impairment metals- induced in human epithelial alveolar cells
No full textProduzione endogena di ROS e cronicizzazione del danno a carico dell’epitelio respiratorio per esposizione a metalli di transizione.
No full textNostri precedenti studi hanno rilevato un marcato effetto genotossico in cellule dell’epitelio alveolare dopo contatto con la frazione idrosolubile di oil fly ash. Questo, dovuto in particolare alla produzione del radicale OH°, chiaramente indica il ruolo svolto dai metalli di transizione V, Fe e Ni nelle reazioni Fenton-like. Poiché ulteriori indagini hanno mostrato, anche nella progenie di cellule esposte, un marcato effetto genotossico si è voluto verificare se questo fosse dovuto, cessata l’esposizione ai metalli, a una maggiore presenza di specie radicaliche di origine mitocondriale e, quindi, ad uno stress ossidativo endogeno che, subentrando a quello esogeno, determina la cronicizzazione del danno a livello dell’epitelio respiratorio. Materiali e Metodi- Le tre successive subculture ottenute sottoponendo a passaggi seriali pneumociti umani, precedentemente messi a contatto con OFA, venivano marcati con 2’,7’-diclorofluoresceina-diacetato (DCF-DA) o con diidrorodamina (DHR) per la determinazione dei ROS sia quantitativa in citofluorimetria che qualitativa in microscopia confocale laser.
RISULTATI: Le prove, effettuate in triplicato, seppure rilevavano nella progenie una significativa (p<0.01) riduzione della fluorescenza rispetto agli pneumociti esposti evidenziavano ancora nelle 3 successive subculture un incremento medio dei ROS del 70% rispetto ai controlli negativi. In particolare, in questi ultimi la fluorescenza emessa era del tutto trascurabile essendo esclusivamente imputabile alla fisiologica formazione, di superossido anione e H2O2, quali sottoprodotti della respirazione cellulare. All’analisi qualitativa in microscopia confocale la progenie delle cellule trattate mostrava, in assenza di alterazioni morfologiche, una discreta fluorescenza citoplasmatica con addensamenti perinucleari, analoga per i due fluorocromi.
CONCLUSIONI: I risultati spiegano chiaramente come lo stress ossidativo, innescato dall’esposizione ai metalli adsorbiti alle polveri fini, in seguito all’alterazione della funzionalità mitocondriale da noi rilevata con rodamina123, determina uno stress ossidativo endogeno in grado di perpetrare l’ossidazione anche del DNA come da noi rilevata all’halo-comet ed al test dei MN
Il rischio da fumo passivo: citotossicità, danno ossidativo e genotossicità
No full textOBIETTIVI: Bronchite, enfisema e cancro sono le patologie più comunemente
correlate al fumo di sigaretta che rappresenta ancora l’inquinante indoor più
rilevante a cui si è passivamente esposti. Il fumo è una miscela complessa,
composta da una fase gassosa (acroleina, formaldeide, acidi organici ecc)
e una solida e liquida (particolato fine, ricco in radicali) la cui composizione
varia in funzione della temperatura di combustione. Questa è pari a ~400°C
nel fumo passivo o Side Stream (SS) mentre in quello inalato dal fumatore,
fumo attivo o Main Stream (MS), la pirolisi di tabacco e carta avviene a 600-
800°C. Allo scopo di accertare il rischio dell’esposizione al fumo passivo è
stato effettuato uno studio in vitro per valutare eventuali differenze nella
citotossicità di MS e SS.
MATERIALI: Sulla linea di pneumociti A549 si rilevavano vitalità cellulare,
produzione di radicali liberi (ROS) e genotossicità, previa esposizione delle
colture sia alle 2 fasi gassose e ai 2 tipi di particolato fine separatamente
che, ancora, alle miscele. MS e SS erano ottenuti in soluzione acquosa da
sigarette standard utilizzando una macchina da fumo.
RIASSUNTO: Il test di vitalità MTT mostrava una citotossicità del SS
(particolato fine più fase gassosa) maggiore rispetto al MS (P<0.01). Alla più
alta dose saggiata (1.25 sigarette/l) la mortalità, imputabile per entrambi alla
fase gassosa, era 5.3% e 60.1% in MS e SS rispettivamente. La determinazione
fluorimetrica dei ROS mostrava lo spiccato potere pro-ossidante del
particolato. La produzione di ROS era maggiore nel MS (P<0.01).Il Cometassay
mostrava un’elevata genotossicità e i valori di DNA nella coda erano
di 2.5 e 3.0 volte superiori al K in SS e MS rispettivamente.
CONCLUSIONI: I dati preliminari inducono a ritenere che la spiccata
citotossicità del SS e, quindi, il danno a carico dell’epitelio bronchiale e
polmonare possa essere responsabile dell’ alta incidenza di CPOD negli
esposti al fumo passivo
Effetto genotossico dei metalli per le otturazioni dentali su cellule esfoliative del cavo orale
No full textOBIETTIVI-: Un nostro precedente studio di biomonitoring ha rilevato, per la prima volta direttamente sull’uomo, la significativa associazione tra presenza di otturazioni dentarie e danno al DNA linfocitario. Per valutare a livello locale il potenziale genotossico dei materiali utilizzati per le otturazioni, un’analoga indagine è stata condotta in un campione di giovani adulti su cellule esfoliative del cavo orale.
MATERIALI E METODI: Sono state esaminate, mediante il comet assay ed il test dei micronuclei, cellule esfoliative di 63 individui 25 maschi e 38 femmine (età 21,02 ± SD 2,11) di cui 20 controlli e 43 trattati. Quest’ultimo gruppo,il cui numero medio di otturazioni era 3.7 (DS 2,96), era costituito per il 48,8 % da soggetti con otturazioni solo in metacrilato, per il 18,6 solo in amalgama e il 32.6 % con entrambi i materiali.
RISULTATI: Dopo accurata standardizzazione del protocollo d’analisi al comet assay si osservava un’associazione tra presenza di otturazioni e danno al DNA con valori di mediane per TL, TDNA% e TM rispettivamente pari a 110.2, 19.82 e 34.2 nei controlli e 143.88, 27.92 e 63.79 negli esposti. Tali valori presentavano un p<0.01 per il 5°, 10° e 25° percentile. Analogamente a quanto osservato a livello linfocitario, non si rilevavano differenze significative in funzione dei materiali utilizzati ma una significativa correlazione col numero di otturazioni (p<0.01). I risultati erano confermati all’esame citologico che mostrava un incremento del n° di MN del 53% nei soggetti con otturazioni rispetto a quelli di controllo.
CONCLUSIONI: L’utilizzo di cellule più intimamente esposte ai costituenti delle otturazioni dentali ne conferma il potenziale rischio genotossico, già da noi rilevato a carico dei linfociti. L’effetto di questa esposizione iatrogena a xenobiotici è certamente imputabile al danno ossidativo che, come rilevato in vitro, esplicano sia le amalgame che i metacrilati
Effetti a lungo termine da metalli adsorbiti alle polveri fini. Valutazione mediante Halo-Comet e test dei micronuclei(MN)
No full textOBIETTIVI: Studi sugli effetti a breve termine da oil fly ash (OFA) rilevavano una significativa associazione (p<0.01)tra esposizione e danno ossidativo
a carico del DNA (analisi della 8-ossi-dG). Per misurare il rischio reale associato a questi xenobiotici è però necessario considerare i meccanismi omeostatici di riparazione e, pertanto, in questo
studio gli effetti genotossici venivano valutati non sulle cellule esposte ma sulla progenie, riproducendo in vitro quanto verosimilmente avviene nell’organismo
in toto dopo fissazione del danno.
MATERIALI E METODI: Colture di pneumociti umani, dopo contatto overnight con soluzioni di OFA costituite da V, Fe e Ni (32.1,58.5e 9.4%rispettivamente) e con soluzioni dei singoli metalli, venivano poste in crescita e, a confluenza dei monostrati, sottoposte a passaggi. Sulle tre successive subculture venivano effettuati l’Halo-Comet e, per conferma, il test MN con citocalasinaB.
RISULTATI: Gli esperimenti, effettuati in triplicato, pur rilevando nella progenie significativi decrementi (p<0.01) del danno rispetto alle cellule esposte,
ancora, evidenziavano differenze significative (p<0.05) del nuclear spreading factor (NFS) rispetto ai controlli negativi ed una marcata correlazione
dose-effetto per le concentrazioni saggiate. Inoltre, l’instabilità genomica, indotta nelle cellule progenitrici dallo stress ossidativo, mostrava
di aumentare nelle generazioni successive con incrementi pari a 21.2, 69.0 e 115,0% rispettivamente al 1°, 2° e 3° passaggio. Anche le prove
con soluzioni di vanadio o ferro alle stesse concentrazioni presenti negli OFA mostravano analoghi risultati confermati al test dei MN.
CONCLUSIONI: Analogamente a quanto osservato per le radiazioni ionizzanti, i risultati evidenziano la capacità del campione ambientale d’indurre danni genomici
anche nelle generazioni successive confermando il potenziale rischio genotossico da stress ossidativo metalli-indotto, già osservato a breve termine.
Pertanto, quando i livelli d’ossidazione saturano i sistemi enzimatici di riparazione, il danno a carico del DNA può indurre, in cellule a rapido turnover quali le
epiteliali, mutazioni alla base del processo multistadi d’insorgenza del cancr
Funzionalità mitocondriale in pneumociti sottoposti a stress ossidativo
No full textOBIETTIVI: La significativa perossidazione lipidica da noi evidenziata in
cellule dell’epitelio respiratorio esposte ad oil fly ash (OFA) e principalmente
imputabile all’azione ossidante del vanadio in esse presenti, ci ha indotto
a studiarne gli effetti a carico dei mitocondri. È infatti ormai riconosciuto il
ruolo chiave da essi svolto nella patogenesi di molte malattie cronicodegenerative,
compreso il cancro, grazie anche alla loro maggiore produzione
di specie radicaliche in seguito all’alterazione della catena di trasporto
degli elettroni.
MATERIALI E METODI: Colture di cellule epiteliali alveolari A549, dopo
contatto con OFA, venivano marcati con rodamina123 e con nonyl-acridine-orange
(NOA) per la determinazione rispettivamente del potenziale transmembranario
(ø) e della massa mitocondriale e quindi sottoposte ad
analisi citofluorimetrica ed in microscopia confocale laser. Per la fisiologica
variabilità del comparto mitocondriale in funzione del ciclo cellulare le
analisi venivano effettuate dopo sincronizzazione mediante starvation.
RISULTATI: Gli esperimenti, effettuati in triplicato, rilevavano minime variazioni
della massa mitocondriale tra cellule trattate e di controllo ma
altamente significative (p<0.01) riduzioni del potenziale transmembranario
già dopo 2h di esposizione a concentrazioni tali (£ 137.2μM VO2SO4
) da non
influire sulla vitalità cellulare. Il ruolo svolto dal campione ambientale sulla
funzionalità di questi organuli si evidenziava in particolare quando maggiore
era la % di cellule nelle fasi G2/S e la massa mitocondriale presentava
un fisiologico decremento pari a ~20%. In queste condizioni, infatti, il ø
nelle cellule trattate si riduceva del 40% rispetto al controllo negativo.
CONCLUSIONI: I risultati mostrano chiaramente come lo stress ossidativo
innescato dall’esposizione ai metalli adsorbiti alle polveri fini determina,
oltre ai più studiati effetti genotossici, anche alterazione della funzionalità
mitocondriale. Quest’ultima, in particolare, è in grado di indurre cronicizzazione
dello stress ossidativo per la maggiore produzione di specie radicaliche
in seguito ad alterato trasporto degli elettroni
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