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Caratterizzazione funzionale di geni per l’adattabilità a stress ambientali in piante di interesse agrario e forestale.
No full textLa caratterizzazione di geni coinvolti in processi adattativi rilevanti, quali la resistenza allo stress idrico, riveste un ruolo molto importante per la possibilità di utilizzare i geni stessi in programmi di monitoraggio della variabilità genetica insieme ai marcatori molecolari "classici" ritenuti selettivamente neutrali dal punto di vista adattativo. Nelle Angiosperme sono stati caratterizzati numerosi geni attivati da condizioni di stress idrico, che codificano per diverse classi di proteine, quali piccole proteine idrofiliche (LEA), dismutasi, perossidasi, o attivatori trascrizionali della classe MYB o MYC. Molti di questi geni sono anche indotti dall'acido abscissico (ABA), il che lascia supporre che i meccanismi di difesa dallo stress siano simili in tutte le piante. In diverse specie (grano, riso, orzo, Arabidopsis) sono anche state caratterizzate le sequenze specifiche dei promotori dei geni indotti da ABA e/o stress idrico. In Arabidopsis, una nuova classe di attivatori trascrizionali recentemente caratterizzati, i DREB (Dehydration-Response Element Binding protein), è coinvolta nella risposta a stress da essiccamento, in particolare, la famiglia genica DREB2 è, sempre in Arabidopsis, attivata da stress idrico.
Il ruolo preciso dei prodotti genici dei geni coinvolti non è ancora stato chiarito, tuttavia, utilizzando piante transgeniche, in riso e in Arabidopsis è stata messa in evidenza una correlazione tra l'aumento di espressione dei geni indotti da stress idrico e maggiore tolleranza della pianta.
Scopo di questo progetto è l'isolamento, in una Conifera modello, il Pino d'Aleppo (Pinus halepensis Mill.) di geni omologhi a quelli delle classi rab, myb e DREB dimostrati coinvolti nella resistenza a stress idrico nelle Angiosperme. Il progetto, sui due anni previsti, sarà articolato come segue : nel primo anno della ricerca si effettueranno
- ricerca di geni omologhi in Pinus halepensis, basandosi sul saggio di una banca di cDNA (già disponibile), e mediante la costruzione di primers degenerati basati sulle sequenze conservate dei geni delle classi rab, myb e DREB che consentiranno di cercare direttamente sul genoma i geni bersaglio;
- costituzione di un set di marcatori molecolari (AFLP e microsatelliti) in Pinus halepensis. Per i microsatelliti, verranno innanzitutto saggiati quei primer che hanno avuto successo in altre conifere, data la notevole trasferibilità riscontrata per questa classe di marcatori (dati personali).
Il secondo anno della ricerca proposta prevede:
- sequenziamento e caratterizzazione molecolare dei geni trovati. Questo consentirà di effettuare analisi di tipo filogenetico, per stabilire la natura dell'evoluzione di queste famiglie geniche, e di tipo strutturale-funzionale, studiando le omologie delle sequenze geniche e delle proteine previste prodotte con le rispettive sequenze depositate nelle banche dati internazionali.
- le stesse sequenze verranno utilizzate in un programma di analisi della variabilità genetica delle popolazioni naturali di Pino d'Aleppo, basato anche sulle relazioni di concatenazione con i marcatori molecolari ottenuti.
Il programma sarà facilitato dalla disponibilità di una banca a cDNA presso un altro laboratorio (DPVTA, Udine), partecipante allo stesso progetto. Inoltre, il proponente ha la disponibilità, presso la struttura di appartenenza, di un sequenziatore automatico di DNA, che permetterà di ridurre in modo notevole i tempi di realizzazione di alcune parti del progetto
Adattamento a cambiamenti climatici in specie forestali mediterranee: un approccio di genomica di popolazioni.
No full textLa conoscenza della componente genetica della biodiversità, ovvero la diversità genetica, ha un ruolo strategico in programmi volti a preservare il potenziale
adattativo delle popolazioni rispetto ai cambiamenti ambientali, specialmente in condizioni che si modificano rapidamente, come di fatto avviene oggi. La
biodiversità forestale è una delle principali componenti degli ecosistemi terrestri ed una delle più minacciate, infatti, nelle specie forestali, con la riduzione
dell'habitat occupato dagli ecosistemi e con la frammentazione degli areali di distribuzione, la diversità genetica subisce perdite che possono compromettere in
queste specie la capacità di adattamento. Vista la crescente preoccupazione sull'impatto delle attività umane sugli ecosistemi e i cambiamenti climatici previsti, il
mantenimento dei meccanismi che generano diversità nelle foreste è diventato un tema centrale poiché, appunto, determina la stabilità degli ecosistemi terrestri e la
sostenibilità delle risorse. Tale preoccupazione si origina dall'osservazione di una significativa discrepanza tra la lunghezza dei cicli vitali delle specie forestali e la
rapidità dei cambiamenti ambientali a cui si aggiunge il fatto che, come testimoniano molti dati paleo-botanici, il potenziale di migrazione degli alberi ha una
velocità molto inferiore del tasso attuale dei cambiamenti ambientali.
Uno degli obiettivi principali della genetica di popolazioni moderna e della genetica evolutiva è quello di identificare i geni coinvolti nella determinazione di
caratteri a valenza adattativa, che sono quei geni che subiscono l'effetto della selezione per l'adattamento a mutate condizioni ambientali e che quindi contribuiscono
all'evoluzione delle popolazioni. La maggior parte dei geni che controllano caratteri adattativi è costituita da geni che controllano caratteri quantitativi (QTL). Negli
alberi forestali sono stati descritti molti clini reativi a variazioni adattative che verosimilmente sono il prodotto della variazione in un numero limitato di geni e di vie
biosintetiche. Le strategie classiche per l'identificazione di questi geni non sono efficaci nelle specie forestali per il lungo tempo di generazione, la difficoltà di
ottenere generazioni segreganti e soprattutto le grandi dimensioni del genoma, che rendono impraticabili approcci di scansione del genoma alla ricerca di regioni
coinvolte nel carattere in esame. Una nuova strategia, la mappatura per associazione (AM) consiste quindi nel percorso inverso: a partire da geni candidati, la
ricerca di linkage disequilibrium (LD) tra sostituzioni di basi (SNP) studiate a livello della sequenza codificante e il carattere in esame. Lo scopo principale di questo
progetto coordinato di ricerca è porre le basi per l'AM di caratteri adattativi in conifere mediterranee, il cui habitat è particolarmente sottoposto agli effetti dei
cambiamenti climatici (principalmente nell'innalzamento delle temperature e nell'aumento dello stress idrico). Il Progetto si focalizzerà sull'analisi di sequenza di
geni candidati per la resistenza a stress idrico, la difesa da parassiti, la fenologia della gemma e la formazione del legno. Ciascuno di questi caratteri rappresenta un
tratto di valenza adattativa, specialmente in considerazione dei cambiamenti climatici in atto. Le specie studiate, tutte di grande importanza ecologica in ambienti
Mediterranei, saranno: il Pino marittimo (Pinus pinaster), il Pino domestico (Pinus pinea), il Pino d'Aleppo (Pinus halepensis) e l'Abete bianco (Abies alba). Tutte le
specie presentano gradienti ben pronunciati per i caratteri in esame e i dati paleobotanici consentono di individuarne le popolazioni di sicura origine naturale. Per
ciascun carattere e ciascuna specie saranno selezionati da banche dati già esistenti per altre Conifere 30 geni candidati, che saranno sequenziati su 12
megagametofiti, uno da ciascuna di 12 popolazioni scelte lungo tutto l'habitat. Questo consentirà di identificare SNP nella regione codificante dei geni e di sceglierne
10 per classe per la fase successiva. In una seconda fase, i 10 geni saranno sequenziati su 12 megagametofiti da ciascuna delle 12 popolazioni. I dati ottenuti
consentiranno di stimare: il grado di diversità nucleotidica, il grado di differenziamento tra popolazioni, di mettere in evidenza tracce di avvenuta selezione a carico
dei geni, di valutare l'entità e il tasso di decadimento del LD entro e tra geni ed entro e tra popolazioni. Questi dati saranno il punto di partenza per selezionare
quelle popolazioni adatte per studi di AM. Sempre a questo proposito, la definizione di SNP che caratterizzino aplotipi particolari (htSNP) permetterà di ottimizzare
le procedure di genotipizzazione e di determinare, ai fini conservazionistici, delle FSU (Functionally Significant Units) per le specie studiate. La definizione delle
FSU sarà di importanza nella progettazione di strategie gestionali basate su dati genetici
Strategia del gene candidato nelle piante: un approccio bioinformatico integrato.
No full textLe copiose informazioni di sequenza di molecole di interesse biologico che provengono da numerosi progetti di sequenziamento di genomi interi o di banche a cDNA hanno contribuito in modo decisivo alla crescita della Genomica come disciplina a sé stante, ed hanno fornito al ricercatore la possibilità di analizzare da prospettive diverse i sistemi biologici. Le banche dati gemelle dell’NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e dell’EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk) forniscono la fonte centrale di informazione relativa a sequenze nucleotidiche e aminoacidiche, oltre a provvedere strumenti per il recupero dei dati. La disponibilità di banche dati complete e ben integrate tra i diversi aspetti dell’informazione di sequenza, dell’espressione genica, dell’interazione tra proteine e della variabilità genetica, rende possibile nuovi approcci per la scoperta di nuovi geni o nuove relazioni tra geni basati su metodi computazionali. La massa di informazioni disponibili rende necessari lo sviluppo e l’uso di sistemi bioinformatici per mettere a disposizione i dati alla comunità scientifica, in modo da consentire:
- l’immagazzinamento dei dati in forma disponibile per un facile recupero delle informazioni;
- identificazione delle omologie di sequenza;
- predizione di geni;
- predizione di sequenze regolatrici;
- confronto tra sequenze conservate dal punto di vista evolutivo a scopi filogenetici.
Per quanto riguarda il regno vegetale, è stato recentemente sequenziato il primo genoma completo di una pianta superiore (The Arabidopsis Initiative, 2000) e sono stati costituiti diversi centri di raccolta dell’informazione genetica relativa a piante di interesse, tra cui spicca il Rice Genome Project (rgp.dna.affrc.go.jp), ma anche il Computational Biology Centers (www.cbc.umn.edu), il Maize Genome Database (www.agron.missouri.edu) e GrainGenes (wheat.pw.usda.gov) sono di grande utilità. Sono a disposizione online numerosi strumenti quali FASTA, BLAST (e le sue varianti PSI-BLAST e PHI-BLAST per le proteine), strumenti per la ricerca di ORF in una sequenza data, per la costruzione di primer ed altro (vedi www.ncbi.nlm.nih.gov per una rassegna di quanto disponibile).
Lo sviluppo dei database ha portato anche ad uno sviluppo di nuovi metodi informatici: sono stati prodotti software per l’analisi e l’annotazione di sequenze genomiche (Huang et al., 1997), per l’allineamento di genomi interi, che dovrebbe facilitare l’analisi di regioni sinteniche ed i confronti di tipo evolutivo (Delcher et al., 1999) e strumenti per l’identificazione di sequenze geniche (Fortna & Gardiner, 2001, per una descrizione generale).
Per quanto evoluti siano però gli strumenti informatici, ed elevata la loro capacità di estrarre informazioni dai database di sequenza, rimane indispensabile l’integrazione tra dati sperimentali e previsioni effettuate in silico. Ad esempio, le previsioni sul numero dei geni umani, basate su una combinazione di software predittivi e ricerche di similarità in banca dati, soffrono di limitazioni dovute alla modellistica usata ed al contenuto informativo dei database stessi, ed hanno portato a stime variabili tra i 35.000 (Ewing & Green, 2000) ed i 120.000 (Liang et al., 2000) geni. In una recente analisi (Fortna & Gardiner, 2001), diversi programmi sono stati saggiati per la loro capacità di predire la posizione degli esoni in geni umani noti, con risultati buoni, ma non esatti al 100%: in particolare, la percentuale di falsi positivi rimane elevata; questo esempio è paradigmatico, in quanto dimostra come in casi del genere anche la migliore predizione debba essere suffragata da dati sperimentali, quali ad esempio la RACE o la RT-PCR.
Pertanto i migliori risultati si possono avere quando le risorse bioinformatiche agiscono a supporto di un gruppo di ricerca che abbia tra i suoi scopi quello dell’integrazione tra dati di sequenza, caratterizzazione funzionale dei geni, raccolta dei mutanti, costruzione di mappe genetiche. In questo modo, risultano inoltre facilitate l’integrazione e la diffusione dei dati prodotti tra i componenti del gruppo di ricerca stesso. Un esempio di possibile integrazione tra gruppi di lavoro in laboratorio e al computer viene proposto in questo progetto di ricerca, per individuare e mappare geni candidati al controllo di processi di sviluppo nelle piante, mediante:
i – trasferimento dell’informazione tra specie, con la ricerca di omologie in banche dati genomiche o di EST;
ii – mappatura delle sequenze nella specie di interesse, attraverso l’uso di polimorfismi nelle sequenze stesse, allo scopo di individuare cosegregazione con il fenotipo studiato.
A questo proposito, una delle strategie più promettenti è rappresentata dall’uso degli SNP (Single Nucleotide Polymorphisms), differenze a singola coppia di basi nelle sequenze di DNA di individui diversi: l’identificazione degli SNP deve essere effettuata per sequenziamento, ma può anche essere effettuata computazionalmente in silico, ad esempio confrontando EST derivate da banche a cDNA diverse. I metodi informatici possono così consentire l’identificazione di geni candidati e della funzione delle proteine, sempre basandosi sulla ricerca di similarità di sequenza.
L’uso di tecniche ad alta resa, quali gli SNP, rende necessario lo sviluppo non solo di metodi per l’immagazzinamento dei dati, ma anche per la loro integrazione ed il loro recupero, in modalità diverse secondo l’uso che si vuole fare delle informazioni raccolte (Strivens et al., 2000)
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