1,721,007 research outputs found
Functional characterization of histidine domain-protein tyrosine phosphatase (HD-PTP) in tumor development
No full textHistidine Domain containing Protein Tyrosine Phosphatase (HD-PTP/PTPN23) is part of the ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) complex with previously established function in cell surface receptor sorting, signaling and multi-vesicular body biogenesis. HD-PTP is encoded by the PTPN23 gene, which maps to chromosomal region 3p21.3, reported to be frequently deleted in various human cancers. However, the bona fide tumor suppressive role of HD-PTP has not been demonstrated yet. In this study we have investigated Ptpn23's tumor suppressor function in vivo and we further assessed its role in cellular transformation and NF-κB pathway modulation in vitro.Components of the ESCRT complex have long been proposed to act as tumor suppressors. Here we show for the first time that PTPN23/HD-PTP, an ESCRT associated protein, exhibits tumor suppressor function in vivo. Ptpn23 hemizygous knockout mice are susceptible to the development of spontaneous B-cell lymphoma and lung adenocarcinoma. Moreover, B-cell lymphoma onset and dissemination were significantly potentiated by hemizygous loss of Ptpn23 in the transgenic Eµ-myc mouse model. Tumors derived from the Ptpn23+/- mice maintained HD-PTP expression and exhibited impaired apoptosis together with reduced levels of the ARF tumor suppressor. In addition, PTPN23 hemizygous loss resulted in partial cell transformation and increased migration/invasion. Furthermore, analysis of human cancer gene expression data revealed that heterozygous loss of PTPN23 is common in many human cancers, which is correlated with poor survival. This suggests that PTPN23/HD-PTP is a prominent tumor suppressor gene in human malignancies. Moreover, we identified a new function for HD-PTP in TNFα-induced canonical NF-κB activation downstream of TNFR1 receptor. We have shown that HD-PTP depleted cells have increased cell surface TNFR1 and increased TNFR1 signaling complex formation which occurs due to defect in TNFR1 degradation in the context of HD-PTP deficiency. Furthermore, we have identified HD-PTP as a negative regulator of NF-κB pathway via TNFR1 receptor. We have shown that HD-PTP depleted cells display faster kinetics of NF-κB activation, increased target gene expression and inflammatory cytokine secretion upon TNFα stimulation. This suggests that HD-PTP inhibits NF-κB activation by controlling cell surface TNFR1 levels and recruitment of adaptor molecules to TNFR1 in order to attenuate the signaling cascade.In conclusion, these data suggest that PTPN23 is a haplo-insufficient tumor suppressor gene involved in tumor initiation, progression and NF-κB signaling, demonstrating for the first time the importance of an ESCRT component, HD-PTP, in tumorigenesis and immunity. Further investigation is required to determine the exact molecular mechanism of HD-PTP in tumorigenesis, inflammation and cancer.La proteine Histidine Domain containing Protein Tyrosine Phosphatase (HD-PTP) fait partie du complexe ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport), un complexe multiprotéique responsable du triage endosomal des récepteurs cellulaires de surface, ainsi que de la signalisation et de la formation des endosomes multi-vésiculaires (MVBs). La protéine HD-PTP est le produit du gène PTPN23, localisé dans la région chromosomale 3p21.3, une région fréquemment perdue dans plusieurs types de cancers humains. Néanmoins, la fonction suppresseur de tumeurs de HD-PTP n'a jamais été démontrée. Cette étude évalue la fonction suppresseur de tumeurs de HD-PTP in vivo, ainsi que le rôle de HD-PTP dans la transformation cellulaire et dans la régulation de la voie de signalisation NF-κB. Il a été précédemment suggéré que les constituants du complexe ESCRT agissent comme suppresseurs de tumeurs. Dans cette étude, nous démontrons pour la première fois la fonction suppresseur de tumeur de HD-PTP, une protéine associée avec la machinerie ESCRT. En effet, les souris hémizygotes pour Ptpn23 sont susceptibles au développement spontané de lymphomes à cellules B et d'adénocarcinomes pulmonaires. De plus, la perte d'une allèle de Ptpn23 potentialise significativement l'apparition et la dissémination de lymphomes induits dans le modèle transgénique murin exprimant l'oncogène Myc (Eμ-Myc). Les tumeurs dérivées des souris Ptpn23+/- préservent l'expression hémizygote de HD-PTP et démontrent des niveaux réduits d'apoptose et d'expression du suppresseur de tumeurs ARF. De plus, la déficience hémizygote de Ptpn23 induit la transformation partielle des cellules et augmente le phénotype pro-migratoire et pro-invasif de celles-ci. L'analyse de données d'expression génique de cancers humains révèle que la perte partielle de l'expression de PTPN23 est fréquente dans plusieurs types de tumeurs humaines et corrèle avec un mauvais pronostic.Par ailleurs, nous avons identifié une nouvelle fonction de HD-PTP dans la régulation de la voie de signalisation canonique de NF-κB suite à une stimulation du récepteur TNFR1 avec TNFα. Nous avons démontré que les cellules déficientes pour HD-PTP ont des niveaux élevés de TNFR1 à la surface membranaire et une formation accrue de complexe de signalisation recruté subséquemment. Ces effets sont dus à une diminution de la dégradation de TNFR1 lorsque l'expression de HD-PTP est supprimée. Collectivement, ces effets mènent à une activation plus rapide de NF-κB et de l'expression de gènes spécifiques à cette cascade de signalisation, ainsi que l'augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires suite à une stimulation avec le TNFα. Nos résultats suggèrent que HD-PTP agit comme un inhibiteur de la voie de signalisation de NF-κB en modulant les niveaux d'expression de TNFR1 à la surface cellulaire et en régulant l'assemblement du complexe de signalisation afin d'atténuer la signalisation en aval. En résumé, nos résultats suggèrent fortement que Ptpn23 est un suppresseur de tumeurs haplo-insuffisant impliqué dans l'initiation de tumeurs, dans leur progression et dans la voie de signalisation NF-κB. Ces observations confirment pour la première fois le rôle suppresseur de tumeurs d'une composante de la machinerie ESCRT. Des études supplémentaires seront nécessaires afin d'élucider le mécanisme moléculaire précis de HD-PTP régulant l'inflammation et le cancer
Investigation of the Folliculin (FLCN) tumor suppressor gene in energy metabolism
No full textBirt–Hogg–Dubé (BHD) syndrome is an autosomal dominant hereditary disorder characterized by skin fibrofolliculomas, lung cyst, spontaneous pneumothorax and renal cell carcinoma (RCC). This condition is caused by germline mutations of folliculin (Flcn) gene, which encodes a 64-kDa protein named folliculin (FLCN). The AMP-actived protein kinase (AMPK) is a master regulator of cellular energy homeostasis. FLCN interacts with AMPK through FLCN-interacting proteins (FNIP1/2). Molecular function of FLCN and how FLCN interacts with AMPK in energy metabolism are largely unknown. We used mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and adipose specific Flcn knockout mouse model to investigate the role of Flcn and its function associated with AMPK in energy metabolism.We found that loss of FLCN constitutively activates AMPK, which in turn leads to elevation in peroxisome proliferator-activated receptor gama coactivator 1 α (PGC-1α), which mediates mitochondrial biogenesis and increase reactive oxygen species (ROS) production. Elevated ROS induces hypoxia-inducible factor (HIF) transcriptional activity and drives Warburg metabolic reprogramming. These findings indicate that Flcn exert tumor suppressor activity by acting as a negative regulator of AMPK-dependent HIF activation and Warburg effect.To investigate the potential role of FLCN/AMPK/ PGC-1α in fat metabolism, we generated an adipose-specific Flcn knockout mouse model. Flcn KO mice exhibit elevated energy expenditure associated with increased O2 consumption, and are protected from diet-induced obesity. Importantly, loss of FLCN leads to increase in AMPK-dependent PGC-1 α and ERR α signaling, which are recognized as thermogenic and/or key regulators of mitochondrial biogenesis. Accordingly, several mitochondrial genes including uncoupling protein 1 (UCP1) are upregulated in Flcn KO white adipose tissue (WAT). As a consequence, the Flcn KO mice are more resistant to cold exposure associated with a higher UCP1 expression, which promotes fat burning by heat.Taken together, FLCN is a negative regulator of AMPK. Loss of Flcn results in AMPK dependent PGC-1 α activation, which 1) drives tumorigenic metabolic adaptation by ROS induced HIF activity, 2) inhibits fat accumulation by increased FAO and UCP1 expression.Le syndrôme Birt-Hogg-Dubé (BHD) est une maladie autosomale dominante héréditaire charactérisée par des troubles de la peau, des kystes pulmonaires, des pneumothorax spontanés et l'apparition de tumeurs rénales. Cette condition est causée par des mutations germinales dans le gène codant pour la protéine de 64 kDa nommée folliculine (FLCN). La protéine AMPK (AMP-activated protein kinase) est une clé de voute de l'homéostasie énergétique de la cellule. FLCN interagit avec AMPK par le biais de l'interaction avec les FNIP, les FLCN-interacting proteins. On ignore toujours le détail des fonctions moléculaires de FLCN, ainsi que de son impact sur le métabolisme cellulaire à travers son interaction avec AMPK. Dans le cadre des travaux présentés dans cette thèse, nous avons utilisé des fibroblastes embryonniques de souris (MEFs) et des souris avec une délétion ciblé du gène Flcn dans le tissus adipeux de façon à étudier le rôle de FLCN dans l'homéostasie du métabolisme énergétique. Nous avons découvert que la répression ou la délétion de FLCN entraine une activation constitutive d'AMPK qui promeut l'activité de PGC-1α (peroxisome proliferator-activated receptor gama coactivator 1α), menant à une biogénèse accrue des mitochondries et de la production d'espèce réactive d'oxygène (ROS). Cette augmentation de ROS active le facteur de transcription HIF afin de favoriser une reprogrammation du métabolisme vers la glycolyse aérobie (effet Warburg). Ces résultats démontrent que FLCN jouent le rôle de suppresseur de tumeur en réprimant l'activation d'HIF dépendante d'AMPK, bloquant ainsi les changements du métabolisme pro-tumoraux.De façon à étudier le rôle potentiel de la voie FLCN/AMPK/PGC-1α dans le métabolisme des adipocytes, nous avons généré un modèle de souris aillant une inactivation ciblée du gène Flcn au niveau des tissus adipeux. Dans ces expériences, les souris portant la délétion génétique démontraient une augmentation de leur métabolisme avec une plus grande consommation d'O2, leur conférant ainsi une protection contre l'obésité. Nous expliquons cette observation par le fait que la perte de FLCN entraîne une activation de la voie AMPK et de ces effecteurs PGC-1α et ERRα, qui sont reconnus comme des facteurs clés favorisant la biogénèse et l'activité des mitochondries. Ainsi, dans les tissus adipeux des souris porteuses de la délétion, plusieurs gènes associés au métabolisme énergétique sont augmentés, notamment UCP1 (uncoupling protein 1). Par conséquent, les souris porteuses de la délétion Flcn démontrent une thermogène accrue lors de l'exposition au froid, puisque le tissu adipeux de ces souris est énergétiquement plus actif. En conclusion, FLCN est un régulateur négatif de la voie d'AMPK. Ainsi, la répression de FLCN hyperactive la voie d'AMPK et son effecteur PGC-1 α, ce qui entraîne: 1) une adaptation métabolique oncogénique dépendante de l'activité de HIF et 2) une inhibition de l'accumulation des lipides via une activation de leur oxydation
Investigating tumor suppressor genes involved in renal cell carcinomas
No full textKidney cancer is a complex disease comprising several types of renal carcinomas, which are classified in different subtypes based on their histological characteristics. A small number of cases of renal cancers are due to hereditary predispositions and nearly all the knowledge on the molecular pathogenesis of kidney cancers was learned by the investigation of these hereditary forms of renal carcinomas. In this thesis, we studied two hereditary diseases predisposing to the development of kidney cancer, von Hippel Lindau (VHL) and Birt-Hogg-Dubé (BHD) syndromes, and their causative genes, VHL and FLCN respectively. First, we investigated the role of the extracellular matrix (ECM) regulation by VHL during tumorigenesis and angiogenesis, and we demonstrated that inactivation of the VHL-ECM assembly pathway results in highly vascularized tumors with a disrupted ECM. We concluded that loss of the ECM assembly promotes and maintains tumor angiogenesis by providing a way for new blood vessels to invade the tumor tissue. In the second part of this thesis, we developed a novel VHL mouse model to investigate the possible cooperation between VHL and p53 during tumorigenesis. We observed that inactivation of both tumor suppressor genes accelerate the formation of liver hemangiomas and splenic hemangiosarcomas. Furthermore, concomitant deletion of VHL and p53 abolished the development of lymphoma usually associated with loss of p53. Our results indicate that the phenotypes arising following the inactivation of VHL and p53 is organ-dependent. Finally, to study the pathogenesis of the BHD syndrome, we developed a new mouse model using an established embryonic stem cell line. We described the murine Flcn expression pattern and noticed that homozygous disruption of Flcn was embryonically lethal early during development. Furthermore, we observed a continuum of kidney lesions from renal tubules hyperproliferation to rare adenoma. FLCN tumor suppressor role was also substantiated usiLe cancer du rein est une maladie complexe qui comprend différents types de cancers classifiés selon leurs caractéristiques histologiques. Certains cas de cancers rénaux sont attribuables à une prédisposition héréditaire et l'étude de ces formes héréditaires de cancer a largement contribué au développement des connaissances concernant la pathogenèse des cancers rénaux. Le travail décrit dans cette thèse porte sur deux maladies héréditaires prédisposant au développement de tumeurs rénales soit la maladie de Von Hippel-Lindau (VHL) et le syndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD) ainsi que les gènes associés à ces dernières, VHL et FLCN respectivement. Premièrement, nous avons étudié le rôle de la régulation de l'assemblage de la matrice extracellulaire (MEC) par VHL durant la tumorigénèse et nous avons démontré que l'assemblage inadéquat de la MEC corrèle avec une croissance tumorale accrue et induit la formation de tumeurs fort vascularisées. Nous avons conclu que la perte de l'intégrité de la MEC favorise l'angiogénèse tumorale en fournissant une voie permettant aux vaisseaux sanguins d'infiltrer la tumeur. Deuxièmement, nous avons développé un modèle murin pour étudier la coopération potentielle entre VHL et p53 durant le développement tumoral. Nous avons observé que l'inactivation simultanée de VHL et p53 accélère la progression d'hémangiomes du foie et d'hémangiosarcomes de la rate. De plus, la perte concomitante de VHL et p53 inhibe le développement de lymphomes normalement associés à l'inactivation de p53. Nos résultats indiquent que les phénotypes apparaissant suite à l'inactivation de VHL et p53 varient selon l'organe étudié. Finalement, nous avons développé un modèle murin pour étudier de la pathologie associée au syndrome BHD et à avons observé la formation d'un continuum de lésions rénales allant de l'hyperprolifération des tubules rénaux à de rares adénomes. Finalement, nous avons con
Characterizing the novel GTPase function of folliculin and its role in tumorigenesis
No full textBirt-Hogg-Dube (BHD) is an autosomal dominant neoplasia syndrome that increases the risk of developing kidney cancer. Skin hamartomas, lung cysts, pneumothorax and a wide variety of kidney tumours characterize BHD syndrome. Germline inactivation of the gene, which encodes folliculin protein (FLCN), often results in early protein truncation suggesting that loss of function is responsible for development of tumours. The molecular and cellular mechanisms by which FLCN suppresses tumourigenesis remain unclear. Previously, our laboratory demonstrated that FLCN harbored a GTPase activity that was lost in common BHD patient mutations. In this report, we revisit these experiments and conclude that GTPase activity is much weaker than previously observed and is not lost in a panel of BHD mutants. Additionally, GTPase experiments with recombinant GST- FLCN fusion proteins expressed in a bacterial system show little to no activity. Taken together, these data suggest that FLCN does not harbor GTPase activity but may beacting as a regulator of GTPase activity.Birt-Hogg-Dube (BHD) est un syndrome néoplasique de transmission autosomique dominante qui accroît le risque de développer un cancer du rein. Le syndrome BHD est caractérisé par le développement de harmatomes de la peau, kyste pulmonaire, pneumothorax est de diverses tumeurs rénales. Les mutations germinales de BHD, codant pour la protéine folliculine (FLCN), ont pour conséquence une troncation de la protéine ce qui suggère une perte de fonction contribuant au développement de tumeurs. Les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires utilisé par FLCN pour empêcher le développement de tumeurs demeure irrésolu. Précédemment, notre laboratoire de recherche a démontre que FLCN procédait une activité GTPase qui était perdue naturellement par des mutations affectants des patients atteints du syndrome BHD. Cette thèse revisite les essaies expérimentaux antérieurement effectués et conclue que l'activité GTPase et beaucoup plus faible que précédemment observé et n'est pas perdue par des mutations observée chez les patients atteints du syndrome BHD. De plus, des expériences de GTPase avec des protéines recombinant de fusion GST-FLCN exprimées dans un hôte bactérienne possède peu voire aucune activité GTPase. En conclusion, les résultats présentés suggères que FLCN ne possède pas d'activité GTPase mais pourrait jouer un rôle dans la régulation de son activité
Characterization of a novel role of the Birt-Hogg-Dubé tumor suppressor protein in metabolism
No full textThe Birt-Hogg-Dubé (BHD) syndrome is a hereditary human cancer syndrome that predisposes affected individuals to develop skin hamartomas, lung cysts and pneumothorax as well as renal carcinoma. BHD is caused by loss-of-function mutations in the folliculin (FLCN) gene. The molecular function of the FLCN gene product is still largely unknown; opposite and conflicting evidence of mTOR signaling activity has been reported. To further study the development of BHD malignancies, a novel conditional Pax8Cre FLCN floxed mouse model was generated. Pathological analysis revealed that the mice developed a unique and relevant phenotype of renal tubule hyperplasia, multifocal renal cysts, adenomas as well as histiocytic sarcoma. From this model, FLCN-null MEFs were generated to further investigate the molecular pathways by which FLCN suppresses tumorigenesis. Preliminary data showing lengthened survival of FLCN-null MEFs under metabolic stress supports a role for FLCN in nutrient sensing. Upon further investigation, FLCN-null MEFs show an increase in mitochondrial biogenesis as denoted by an increase in AMP:ATP ratio, respiration rates, lactate levels, mitochondrial numbers and PGC1-alpha/beta transcripts. We hypothesize that the previously shown indirect physical interaction between AMPK and FLCN could provide a rationale for the striking metabolic phenotype. To this end, FLCN-null MEFs with stably knocked down levels of AMPKalpha1/2 isoforms were generated in an attempt to rescue the novel metabolic phenotype. Altogether, these studies are aimed to further elucidate the metabolic function of FLCN in order to better understand its role as a tumor suppressor.Le syndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD) prédispose les personnes atteintes à développer des hamartomes de la peau, des kystes pulmonaires et un carcinome du rein. Le syndrome de BHD est causé par des mutations causant la perte de fonction d'un gène encodant la folliculine (FLCN). Les fonctions moléculaires de la FLCN sont encore peu connues. Ici, nous étudions la progression de néoplasmes du syndrome de BHD, tel que de l'hyperplasie kystique et des adénomes rénaux, en utilisant un nouveau modèle de souris transgénique conditionnel Pax8 Cre FLCN. Créés de ce modèle, des fibroblastes embryonnaires de souris (FES) nuls pour l'expression de la FLCN présentent une survie prolongée face à restrictions nutritives de même qu'une augmentation de biogénèse mitochondriale tel que démontré par des taux élevés d'ARN messager de PGC1-alpha/beta, un haut ratio d'AMP:ATP et une augmentation de phosphorylation oxidative. Ensemble, ces données préliminaires et inédites supportent un rôle pour la FLCN dans la détection de nutriments. Nous émettons l'hypothèse que l'interaction précédemment publiée entre la kinase AMPK et le FLCN pourrait expliquer ce phénotype métabolique. Afin de vérifier cette hypothèse, les FES nuls pour la FLCN exprimant des shARN de la kinase AMPK alpha1/2 stable ont été générés. Ensemble, ces études novatrices ont comme but d'élucider les fonctions métaboliques de la FLCN afin de mieux co mprendre son mécanisme de suppression de tumeurs
Characterizing the role of tumor suppressor Folliculin in pathogen resistance
No full textHost defense against infectious diseases caused by pathogens, such as bacteria or viruses, is initiated by the innate immune system and is highly dependent on the expression of various defense genes. These genes are tightly regulated by important transcription factors. Delineating the mechanisms controlling this response is crucial to understand host-pathogen interactions and comprehend how the host organism triggers genes required for pathogen resistance. The 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK), a master regulator of energy homeostasis, also participates in innate immunity. It was recently demonstrated that AMPK is negatively regulated by Folliculin (FLCN), a protein encoded by the BHD tumor suppressor gene, whose loss predisposes to kidney cancer. In addition, it was shown that FLCN loss results in resistance to various stresses in C. elegans and mammalian cells. Accordingly, it was found that there was a significant increase in stress response genes, particularly infection resistance genes, in flcn-1 animals prior to stress. In this study, we observe that flcn-1 mutant worms were more resistant to Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa infection. We further demonstrate that the transcription factor HLH-30 is responsible for this signature and infection resistance phenotypes. Briefly, we observed that HLH-30 was constitutively active in flcn-1 worms indicating that flcn-1 resists pathogen through HLH-30. Moreover, we established that AAK-1 and AAK-2 which are orthologues of AMPK α1 and α2 respectively in C. elegans, were required to confer resistance to S. aureus and may act upstream to HLH-30. This study attempts to establish a genetic linkage between FLCN-1, AAK and HLH-30. This signaling pathway might constitute towards developing a new therapeutic target for the treatment of infectious diseases resistant to several antibiotics.La réponse d'un organisme hôte face à des maladies infectieuses causées par des agents pathogènes tels que les bactéries ou les virus, est initiée par le système immunitaire inné et est hautement dépendante de l'expression de divers gènes de défense. Ces gènes sont étroitement régulés par plusieurs facteurs de transcription. La caractérisation des mécanismes de contrôle de cette réponse est donc cruciale pour comprendre les interactions hôte-pathogène et comprendre comment l'organisme hôte stimule l'expression des gènes nécessaires à la résistance aux pathogènes. La protéine kinase 5'-AMP-activated (AMPK), connue pour jouer un rôle vital dans la régulation de l'homéostasie énergétique, participe également à l'immunité innée. Nous avons récemment démontré que l'AMPK est régulée négativement par FLCN, une protéine codée par le gène suppresseur de tumeur FLCN, dont la perte prédispose au cancer du rein. De plus, nous avons montré que la perte de FLCN favorise la résistance de vers C. elegans et de cellules de mammifères à divers stress. Nos résultats montrent un chevauchement important entre les gènes surexprimés suivant la perte de FLCN et les gènes activés en réponse au stress oxydatif, hyperosmotique ou à une infection pathogénique, précédemment identifiés. Dans cette étude, nous avons observé que les vers déficients pour FLCN sont plus résistants à l'infection par S. aureus et P. aeruginosa. Il a été rapporté que FLCN est un régulateur de TFEB (HLH-30), un facteur de transcription qui stimule l'expression de gènes de résistance aux agents pathogènes chez C. elegans. Toutefois, le rôle de FLCN et AMPK sur la régulation de TFEB et la résistance aux pathogènes demeurait inconnue. Nos résultats démontrent que HLH-30 est constitutivement active chez les vers défectifs pour FLCN, suggérant une augmentation de la résistance à ces agents pathogènes dépendante de HLH-30. De plus, nous avons établi que AAK-1 et AAK-2, les orthologues de l'AMPK α1 et α2 chez C. elegans sont nécessaires pour conférer une résistance à S. aureus et agissent en amont deviiHLH-30. Cette étude tente d'établir un lien génétique entre FLCN-1, AAK et HLH-30. Cette voie signalétique pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de maladies infectieuses résistantes à plusieurs antibiotiques
Identifying the novel GTPase function of FLCN and characterizing its role in aging
No full textBirt-Hogg-Dube syndrome (BHD) is an inherited neoplasia syndrome that predisposes affected individuals to skin hamartomas, lung cysts, pneumothorax and renal carcinoma. Mutations within the BHD locus (also known as FLCN) have been found associated with the disease. Almost all mutations in BHD patients cause a truncated FLCN protein product suggesting a loss-of-function mechanism leading to tumor formation. FLCN is highly conserved across species from yeast to humans suggesting an important biological function. Earlier this year, the exact molecular function of FLCN was still unclear. However, with the aid of the first crystal structure of folliculin carboxy-terminal domain we provide the first insight into the function of folliculin as a novel GTPase. Interestingly this GTPase activity is lost in a naturally occurring disease-causing mutant (C1844G). We then characterize the role of FLCN-1 in the nematode Caenorhabditis elegans in an attempt to determine the signalling pathway(s) to which FLCN-1 belongs. We report a novel role of FLCN-1 in C. elegans aging as a component of the insulin/IGF-1 signalling pathway. FLCN-1 regulates lifespan via a mechanism that is AAK-2/AMPK, DAF-16/FOXO and autophagy dependent. We demonstrate that FLCN-1 negatively regulates AAK-2 phosphorylation independent of the constitutively active PAR-4 kinase. Moreover, flcn-1 null mutants have elevated levels of β oxidation of fatty acids, mitochondrial respiration and ROS generation all of which are dependent on AAK-2. We hypothesis that ROS generation stimulates autophagy activation as a downstream mechanism required for lifespan extension of flcn-1 null mutants. Taken together, these studies are aimed to identify the functional role of FLCN and to clarify its metabolic role in relation to AMPK in order to better understand its tumor suppressor function.Le syndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD) est un syndrome néoplasique héréditaire, qui rend les personnes atteintes plus susceptibles de développer les maladies telles que les harmatomes de la peau, kystes pulmonaires, pneumothorax et carcinomes rénaux. Des mutations dans le locus BHD au niveau du gène de la folliculine (FLCN) sont souvent associées à cette maladie. La majorité des patients présentent des mutations entrainant la troncation de la protéine FLCN, suggèrant un mécanisme de perte de fonction qui entraine la formation de tumeurs. Très conservée à travers les espèces de la levure à l'homme, la FLCN semble avoir une fonction biologique importante, cependant son mécanisme d'action est encore obscure. Néanmoins l'obtention récente de la structure cristallographique du domaine carboxyle terminal de la folliculine suggère qu'elle pourrait fonctionner telle une GTPase. Chose intéressante, cette activité GTPase est perdue naturellement chez les malades portant la mutation C1844G. Afin de déterminer dans quelle voie de signalisation la folliculine appartient, nous avons analysé son rôle chez le nématode Caenorhabditis elegans. Nous rapportons ici le nouveau rôle de la FLCN-1 dans le vieillissement de C. elegans, comme étant un acteur de la voie de signalisation insuline/IGF-1. La FLCN-1 régule la durée de vie à travers un mécanisme dépendant de l'AMPK/aak-2, FOXO/DAF-16 et de l'autophagie. Nous démontrons qu'elle régule négativement la phosphorylation de AAK-2 indépendamment de la kinase constitutivement active PAR-4. Chez les mutants nul flcn-1, les acides gras B oxydes, la respiration mitochondriale ainsi que la production de ROS présentent des niveaux élevés, qui dépendent de AAK-2. Nous proposons que la production de ROS stimule l'activation de l'autophagie, nécessaire pour l'extension de la durée de vie des mutants flcn-1 nul. Ainsi, nos études ont permis d'identifier le rôle fonctionnel de la FLCN et de clarifier son rôle métabolique en lien avec l'AMPK, permettant de mieux comprendre sa fonction de suppresseur de tumeur
Investigating the effects of the von Hippel Lindau tumor suppressor on extracellular matrix function
No full textThe von Hippel Lindau protein (pVHL) is a tumor suppressor that is known to play an important role in clear cell renal cell cancer (ccRCC) development. Many efforts towards understanding the role of pVHL in ccRCC have focused on characterizing its function in HIF degradation and extracellular matrix (ECM) remodeling. The purpose of the current study was to characterize the molecular mechanism by which pVHL regulates assembly of the ECM. To this end, we defined three objectives. First, we sought to determine if pVHL's role as a ubiquitin ligase was independent of its role as a regulator of ECM assembly. Second, in the hope of mimicking the defective ECM that is observed in pVHL null cells, we down-regulated type IV collagen in cells expressing wild type pVHL and then measured the ability of these cells to invade ECM in vitro. Lastly, we aimed to identify the specific binding site of pVHL on alpha 2 collagen type IV. Based on our results, we were able to conclude that pVHL's ubiquitin ligase function is independent of its function in ECM regulation. We also found that decreasing type IV collagen in 786-0 cells resulted in a decreased ability of these cells to invade the ECM. Lastly, we determined that pVHL binds to a 120kDa COL4A2 species.La protéine von Hippel Lindau (pVHL) est un suppresseur de tumeur qui joue un role intégrale dans le développement de ccRCC. À date, plusieurs efforts ont été dirigés pour mieux comprendre ce role en tant que charactérizer sa function dans la dégradation de HIF et durant le processus de remodeler de la matrice extra-cellulaire (MEC). Le but de notre recherche était de charactérizer le méchanisme moléculaire par laquelle pVHL règle l'assemblée de la MEC. Pour attainder ce but, nous avons établis trois objectifs. Premièrement, nous avons voulu cerner si le role dont pVHL joue comme ubiquitine-ligase est indépendant de son role comme régleur de l'assemblée de la MEC. Deuxièmement, dans l'espoir de mimer la MEC défectueuse qui est observée avec les cellules qui n'expriment pas pVHL, nous avons diminué l'expression de collagène type IV dans les cellules dans lesquels pVHL est exprimé et nous avons mesuré la capacité de ces cellules à envahir une matrice artificielle. Finalement, nous avons visé à identifier le site d'intéraction spécifique de pVHL sur COL4A2. Nous étions capables de conclure que l'activité de ligase associée avec pVHL fonctionne indépendamment de sa fonction dans la régulation de la MEC. Nous avons aussi trouvé qu'en diminuant l'expression de collagène type IV dans les cellules 786-0, nous avons réussi à diminuer la capacité de ces cellules à envahir la MEC. Finalement, nous avons trouvé que pVHL intéragit avec un morceau de COL4A2 de 120kDa
Functional characterisation of the hepatitis C virus NS2/3 and NS2 proteins
No full textThe hepatitis C virus (HCV) has infected over 170 million people worldwide and often leads to a chronic infection which can result in liver fibrosis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In order to develop more specific therapies for this disease, thorough understanding of the virus and its proteins is essential. This thesis focuses on the characterisation of two of these HCV encoded proteins, NS2/3 and NS2. The HCV NS2/3 protease cleaves between NS2 and NS3 and we show that NS2/3 activity is absolutely required for genome replication. Indeed, mutation of any of the catalytic active site residues in NS2/3 to alanine results in the inability of NS2 replicons to replicate in both transient and stable replication assays. However this effect is not explained by impairment of the catalytic activities of NS3 as NS3 ATPase, helicase and protease activities are not significantly affected by the presence of uncleaved NS2 in several in vitro and cell based assays. Furthermore, while the mutant uncleaved NS2/3 protein is found to be rapidly degraded in cell systems in a proteasome-dependent manner, NS2 lysine mutagenesis that results in stabilization of uncleaved NS2/3 is insufficient to rescue replication of NS2/3 protease inactive replicons. This suggests that NS2/3 cannot functionally replace NS3 for viral replication and that cleavage to liberate NS3 is absolutely required. Furthermore, we show that cleaved NS2 is also rapidly degraded in transient and stable RNA replication systems and that this degradation is conserved amongst several genotypes, indicating that control of NS2 levels could be important for the viral life cycle. Interestingly, in contrast to uncleaved NS2/3, NS2 degradation does not appear to be dependent on ubiquitination or proteasomal degradation. Finally, several lysine residues in NS2 are identified to be involved in HCV infectivity in a JFH-1 infection system, indicating these are important amino acids/regions involved in viralPlus de 170 millions de personnes sont infectées par le virus de l'hépatite C, une infection souvent chronique qui peut entraîner le développement de graves conséquences pour la santé. Afin de développer des traitements spécifiques contre l'hépatite C, il est essentiel de bien comprendre le fonctionnement moléculaire du virus et les rôles des protéines produites par celui-ci. Cette thèse est donc centrée sur la caractérisation fonctionnelle de deux de ces protéines, NS2/3 et NS2. NS2/3 est une protéase autocatalytique qui clive entre NS2 et NS3. Nous démontrons que l'activité de NS2/3 est essentielle pour la réplication de l'ARN génomique du virus. La mutagénèse dirigée inactivant le site catalytique de NS2/3 rend des réplicons contenant NS2 incapables de se répliquer dans des essais de réplication stables et transitoires. Cependant, cet effet sur la réplication génomique n'est pas le résultat d'une déficience au niveau des activités catalytiques de NS3. Les fonctions ATPase, hélicase et protéase de NS3 ne sont pas affectées de façon significative par la présence de NS2 lors d'essais in vitro et cellulaires. Toutefois, nous démontrons que la protéine NS2/3 inactive est rapidement dégradée par la voie du système ubiquitine-protéasome. Bien que la mutagénèse des lysines de NS2 résulte en une stabilisation des niveaux de NS2/3, ces mutations sont toutefois incapables de surmonter la déficience au niveau de la réplication des réplicons contenant une protéine NS2/3 inactive pour l'autoclivage. Ces résultats suggèrent donc que NS2/3 ne peut accomplir le rôle de NS3 lors de la réplication génomique virale. De plus, nos résultats démontrent que la protéine NS2 est aussi dégradée rapidement dans plusieurs systèmes de réplication de l'ARN du virus. Cette dégradation est observée chez plusieurs génotypes, suggérant que le contrôle des niveaux de NS2 pourrait être important pour le cycle de vie
Characterization of the role of the tumor suppressor FLCN using «Caenorhabditis elegans» and mammalian cells
No full textBirt-Hogg-Dubé is a dominantly-inherited syndrome that increases predisposition to cancer mainly renal tumors and cysts. Folliculin (FLCN), a protein highly conserved across evolution, is the tumor suppressor responsible for this disease. Despite the intensive research effort spent since its discovery in 2001, the cellular role of FLCN remains unclear and how its loss leads to tumorigenesis is not yet defined. FLCN is a binding partner of the 5'AMP-activated protein kinase (AMPK), a central regulator of energy homeostasis. However, the genetic and functional links as well as the phenotypic outcomes on cells/organisms have not been established. In this thesis, we investigated the role of FLCN in the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans) and in mammalian cells. In the first part, we demonstrate that FLCN is an evolutionary conserved negative regulator of AMPK. Loss of FLCN in worms and mammals activates AMPK signaling and induces autophagy, improving cellular bioenergetics, and leading to an advantageous resistance to several metabolic stresses including oxidative stress, anoxia, heat, and nutrient deprivation. In the second part, we highlight the discovery of a novel function for FLCN/AMPK in the regulation of glycogen metabolism and resistance to hyperosmotic stress in C. elegans. We show that loss of flcn-1, leads to AMPK-dependent glycogen accumulation and resistance to hyperosmotic conditions. Upon exposure to salt stress, glycogen reserves are rapidly degraded, leading to the accumulation of the organic osmolyte glycerol, which is crucial for organismal survival to hyperosmotic environments. Importantly, we also show that that the regulation of glycogen metabolism by FLCN is evolutionary conserved and that glycogen accumulates in kidneys from mice lacking FLCN and in renal tumors from BHD patients. Results of this part demonstrate a dual role for glycogen reserves: an energy reservoir and a store that fuels osmolyte production. In the third part, we investigate the transcriptional regulation downstream FLCN-1 in C. elegans. The results of this chapter indicate that the transcriptional profiles upon loss flcn-1 at basal level significantly overlap with published stress response signatures including oxidative stress, hyperosmotic stress, and infection with pathogens. Furthermore, we found that loss of flcn-1 in C. elegans leads to increased resistance to pathogens impinging on a possible role for FLCN-1 in the regulation of innate immunity. Finally, we found that many stress response genes upregulated in flcn-1 animals are downregulated in hlh-30 mutant animals, and that the hyperosmotic stress resistance in flcn-1 nematodes is abolished upon loss of hlh-30, supporting a potential role of the TFEB worm homolog, HLH-30, in stress response downstream FLCN-1. Altogether, these studies have established FLCN as an evolutionary conserved negative regulator of AMPK, and have led to the discovery of two distinct pathways of stress resistance downstream FLCN/AMPK, a pathway of resistance to metabolic stresses and another that confers resistance to hyperosmotic stress, and both pathways might be supporting tumorigenesis.Birt-Hogg-Dubé est un syndrome héréditaire qui augmente le risque de développer un cancer principalement des tumeurs et des kystes du rein. Folliculine (FLCN), hautement conservée à travers l'évolution, est la protéine suppresseur de tumeurs responsable de cette maladie. Malgré l'intense effort de recherche consacré depuis sa découverte, en 2001, la fonction de la protéine FLCN demeure obscure et comment son absence mène au cancer n'est pas encore défini. FLCN est un partenaire de la protéine-kinase (AMPK), un complexe impliqué dans la régulation du métabolisme cellulaire. Toutefois, les liens génétiques, fonctionnels, et phénotypiques n'ont pas été établis. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de FLCN dans l'organisme modèle Caenorhabditis elegans (C. elegans) et dans des cellules de mammifères. Dans la première partie, nous démontrons que FLCN régule négativement l'AMPK, une fonction conservée à travers l'évolution. L'absence de la protéine FLCN active l'AMPK et induit l'autophagie, améliorant la bioénergétique cellulaire, et menant à une résistance avantageuse à plusieurs stress métaboliques incluant le stress oxydatif, l'anoxie, la chaleur et la carence en nutriments. Dans la deuxième partie, nous mettons en évidence la découverte d'une nouvelle fonction du complexe FLCN/AMPK dans la régulation du métabolisme du glycogène et dans l'adaptation au stress hyperosmotique chez C. elegans. Nous démontrons que l'absence de FLCN conduit à l'accumulation du glycogène et à la résistance aux conditions hyperosmotiques de manière dépendante de l'AMPK. Lors de l'exposition à un stress salin, les réserves de glycogène sont rapidement dégradées, conduisant à l'accumulation de l'osmolyte organique glycérol, un facteur essentiel pour l'adaptation de l'animal au stress hyperosmotique. Nous avons également prouvé que la régulation du métabolisme du glycogène par FLCN est conservée à travers l'évolution et que le glycogène s'accumule dans les reins de souris dépourvues de FLCN et dans la tumeur rénale d'un patient atteint par le syndrome BHD. Les résultats de cette partie démontrent un double rôle pour les réserves de glycogène: un réservoir d'énergie et un conservateur important de métabolites intermédiaires pour la production d'osmolytes en cas de besoin. Dans la troisième partie, nous étudions les changements transcriptionnels subis suite à l'absence de flcn-1 chez C. elegans. Les résultats de ce chapitre indiquent un chevauchement significatif avec des groupes de gènes induits par différents types de stress incluant le stress oxydatif, le stress hyperosmotique, et l'infection par des agents pathogènes. En outre, nous avons constaté que l'absence de flcn-1 chez C. elegans augmente la résistance aux pathogènes suggérant un rôle possible pour FLCN-1 dans la régulation de l'immunité innée. Nous avons aussi constaté que de nombreux gènes surexprimés chez les mutants nématodes flcn-1 sont régulés négativement chez les mutants hlh-30 et que la résistance au stress hyperosmotique des nématodes mutants flcn-1 est abolie par l'absence de l'hlh-30, soutenant un rôle possible de l'homologue de TFEB, HLH-30, dans la signalisation d'adaptation au stress en aval de la protéine FLCN-1. Ensemble, ces études ont démontré que FLCN régule négativement l'AMPK à travers l'évolution, et ont conduit à la découverte de deux voies distinctes de résistance au stress en aval de FLCN/AMPK, une voie de résistance aux stress métaboliques et une autre qui confère la résistance au stress hyperosmotique, et les deux voies pourraient soutenir la tumorigenèse
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