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In-depth characterization of myeloid enhanced humanized mouse strains
No full textDespite all progress and developments in the last decades, cancer still is the second lead-ing cause of death. Depending on many factors, such as gender, age, lifestyle and in-come, some cancer types have decreased in incidence and mortality, whereas other can-cer types such as breast cancer incidence and mortality is still rising (1). Unfortunately, oncology is a particular challenging field for developing new drug candidates and hetero-geneity of the different tumor types poses an additional challenge. Moreover, anti-cancer drugs have the lowest clinical success rate compared with other disease areas. This is partly due to the inadequate translation of preclinical findings into clinic trials. Consequent-ly, the improvement of preclinical models is required to enhance the predictive power of preclinical studies and to reduce the failure rate of novel oncology drugs. In recent years cancer immunotherapy became a promising approach in the fight against cancer and thus the need for in vivo models with a functional human immune system has increased (2-5).
With the development of classically humanized mice a big hurdle of preclinical mouse-models was overcome by adequately reflecting human lymphoid system. Howev-er, these classical humanized mouse models still have critical limitations such as the poor reconstitution of human innate immune development. Simultaneously, the significance of tumor-associated myeloid cells and their contribution in tumor progression became more evident. Consequently, transgenic mouse strains expressing human interleukin-3 (IL-3) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), so called myeloid en-hanced NOG-EXL and NSG-SGM-3 mice, were generated based on the importance of these cytokines for innate immune cell differentiation.
In the present study a comprehensive characterization and direct comparison of these novel humanized mouse models was performed with focus on their myeloid recon-stitution to determine which model is most suitable for studies involving human myeloid cell reconstitution. An in-depth characterization of humanization levels in peripheral blood as well as primary and secondary lymphoid organs was conducted with special attention on the myeloid cell populations. It was found that novel models NOG-EXL and NSG-SGM3 display more myeloid cell populations in peripheral blood as well as in primary and second-ary lymphoid organs. Besides monocytes and macrophages also increased levels for hu-man dendritic cells were found. But not only was the occurrence of these cell populations analyzed, but also their functionality. Macrophages as well as pDCs from humanized NOG-EXL (huNOG-EXL) were found to be functional as they are able to react to exoge-nous stimuli with TLR agonists. Thus, this work is the first to describe functional human macrophages and pDCs in huNOG-EXL mice.
Additionally, adaptive immunity was analyzed. Impaired IgG class switch is a common limitation in classical humanized mice, this study also compared the herein ana-lyzed models macroscopically for lymph node and thymus development. In addition, anti-gen-specific IgG production was investigated and high levels were found in the myeloid enhanced models.
The analyzed mouse models showed increased levels of myeloid cells in the periphery. These cells are reported to play an essential role in a variety of solid tumors. Therefore, further investigation concentrated on myeloid immune infiltration in tumors. This is a crucial aspect in cancer immunotherapy, as the abundance of myeloid cells in solid tumors often correlates with poor clinical outcome. Consequently, myeloid enhanced hu-manized mice were transplanted with human xenograft tumors and tumor immune infiltrate was analyzed. The tumor itself contributes to the human cytokine milieu and this raised the question whether immune cell composition in humanized mice is more influenced by the mouse strain used or by the chosen tumor model. Therefore, studying the relative effects of transgenic and tumor-derived cytokines to myeloid cell reconstitution in humanized mice was of paramount importance in this study.
In summary, huNOG-EXL mice were identified as a robust mouse strain to study human immunity. Due to increased IgG levels and the reconstitution of important immune subclasses in different tumor models, they offer a clinical relevant model for cancer im-munotherapy. Additionally, the relatively high percentage of human pDCs allows studying this rare cell population without further manipulation. Specific tumor models were identified that are able of generating functional tumor-associated pDCs that are not based on the cytokine expression of transgenes and that functionally responded to TLR activation. While the choice of the mouse model was essential for differentiation of innate immune subsets in periphery, this impact was lost when focusing on the tumor microenvironment. Tumor-derived cytokines might be able to attract and differentiate innate immune cells even if their frequency in the periphery is low. Thus, it was shown for first time that the tumor mi-lieu but not the mouse background defines intratumoral frequencies of innate immune cell subsets such as pDCs.Trotz aller Fortschritte und Entwicklungen in den letzten Jahrzehnten ist Krebs weltweit immer noch die zweithäufigste Todesursache. Abhängig von vielen Faktoren wie Ge-schlecht, Alter, Lebensstil und Einkommen haben einige Krebsarten an Inzidenz und Mor-talität abgenommen, während andere Krebsarten wie Brustkrebs in Inzidenz und Mortalität immer noch zunehmen (1). Leider ist die Onkologie ein besonders herausforderndes Ge-biet für die Entwicklung neuer Medikamentenkandidaten und die Heterogenität der ver-schiedenen Tumor-Typen stellt eine zusätzliche Herausforderung dar. Darüber hinaus wei-sen Krebsmedikamente im Vergleich zu anderen Krankheitsbereichen die niedrigste klini-sche Erfolgsrate auf. Dies ist teilweise auf die fehlende Translatierbarkeit präklinischer Befunde in klinische Studien zurückzuführen. Folglich ist eine Verbesserung der präklini-schen Modelle erforderlich, um die Vorhersagekraft präklinischer Studien zu verbessern und die Ausfallrate neuartiger onkologischer Arzneimittel zu verringern. In den letzten Jah-ren wurde die Krebsimmuntherapie zu einem vielversprechenden Ansatz im Kampf gegen Krebs und daher hat der Bedarf an in vivo Modellen mit einem funktionierenden menschli-chen Immunsystem zugenommen (2-5).
Mit der Entwicklung klassisch humanisierter Mäuse, welche die Rekonstitution der menschlichen Lymphozyten angemessen reflektieren, wurde bereits eine große Hürde in präklinischen Maus-Modellen überwunden. Diese humanisierten Mausmodelle weisen je-doch immer noch kritische Einschränkungen, wie beispielsweise die schlechte Rekonstitu-tion des menschlichen angeborenen Immunsystems, auf. Gleichzeitig wurde die Bedeu-tung von Tumor-assoziierten myeloischen Zellen und ihr Beitrag zur Tumorprogression deutlicher. Folglich wurden basierend auf der Wichtigkeit dieser Zytokine für die Differen-zierung der Zellen der angeborenen Immunität, transgene Mausstämme entwickelt, die menschliches Interleukin-3 (IL-3) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) exprimieren, sogenannte myeloid-verbesserte NOG-EXL- und NSG-SGM-3-Mäuse.
In dieser Arbeit wurde eine umfassende Charakterisierung und ein direkter Ver-gleich dieser neuartigen Mausmodelle durchgeführt. Dabei lag der Schwerpunkt auf der myeloischen Rekonstitution, um festzustellen, welches Modell für Studien mit menschli-chen myeloischen Zellpopulationen am besten geeignet ist. Es wurde eine eingehende Charakterisierung des Humanisierungsniveaus hinsichtlich der myeloischen Rekonstitution im peripheren Blut sowie in primären und sekundären lymphoiden Organen durchgeführt. Dabei fand sich, dass die neuartigen Modelle NOG-EXL und NSG-SGM3 einen Anstieg an myeloischen Zellpopulationen im peripheren Blut sowie in primären und sekundären lym-phoiden Organen aufweisen. Neben Monozyten und Makrophagen wurden auch erhöhte Level für humane dendritische Zellen gefunden. Es wurde jedoch nicht nur das Auftreten dieser Zellpopulationen analysiert, sondern auch deren Funktionalität. Dabei wurde festge-stellt, dass sowohl Makrophagen als auch pDCs von huNOG-EXL funktionell sind, da sie mit TLR Agonisten auf exogene Stimuli reagieren können. Somit ist die hier vorliegende Arbeit die erste, die funktionelle humane Makrophagen und pDCs in huNOG-EXL-Mäusen beschreibt.
Zusätzlich wurde die adaptive Immunität analysiert. Da ein beeinträchtigter IgG Klassenwechsel bei klassischen humanisierten Mäusen eine häufige Einschränkung dar-stellt, wurden in dieser Studie auch die hier analysierten Modelle makroskopisch auf Lymphknoten- und Thymusentwicklung verglichen. Zusätzlich wurde die Antigen-spezifische IgG-Produktion untersucht und hohe Level in den myeloischen verbesserten Modellen gefunden.
Zusammengefasst wiesen die analysierten Mausmodelle erhöhte Level myeloi-scher Zellen in der Peripherie auf. Es wurde zudem berichtet, dass diese Zellen eine zent-rale Rolle in einer Vielzahl von soliden Tumoren spielen. Daher konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die Infiltration der myeloischen Immunzellen in Tumoren. Dies ist ein wichtiger Aspekt bei der Krebsimmuntherapie, da die Häufigkeit myeloischer Zellen in soli-den Tumoren oft mit einem schlechten klinischen Ergebnis korreliert. Myeloid-verbesserte humanisierte Mäuse wurden folglich mit humanen Xeno-Tumoren transplantiert und das Tumorimmuninfiltrat analysiert. Da der Tumor selbst zum humanen Zytokinmilieu beiträgt, wurde die Frage aufgeworfen, ob die Zusammensetzung der Tumorimmunzellen bei hu-manisierten Mäusen stärker vom verwendeten Mausstamm oder vom gewählten Tumor-modell beeinflusst wird. Die Untersuchung des relativen Einflusses von transgenen Zytoki-nen bzw. von Tumoren-abgeleiteten Zytokinen auf die Rekonstitution myeloischer Zellen bei humanisierten Mäusen war von zentraler Bedeutung in dieser Studie.
Zusammenfassend wurden huNOG-EXL-Mäuse als robuster Mausstamm zur Un-tersuchung der Immunität des Menschen identifiziert. Mit erhöhten IgG-Spiegeln und der Rekonstitution wichtiger Immun-Subpopulatoinen in verschiedenen Tumormodellen bieten sie ein klinisch relevantes Modell für die Krebsimmuntherapie. Darüber hinaus ermöglicht der relativ hohe Prozentsatz menschlicher pDCs die Untersuchung dieser seltenen Zellpo-pulation ohne zusätzliche Manipulation. Es wurden spezifische Tumormodelle identifiziert, die in der Lage sind, funktionelle Tumor-assoziierte pDCs zu erzeugen, die auf die TLR-Aktivierung reagierten und nicht auf der Zytokinexpression von Transgenen beruhen. Wäh-rend die Wahl des Mausmodells für die Differenzierung angeborener Immun-Subpopulationen in der Peripherie wesentlich war, ging dieser Einfluss verloren wenn man sich auf die Tumor-Mikroumgebung fokussierte. Von Tumoren-stammende Zytokine kön-nen möglicherweise Zellen des angeborenen Immunsystems anziehen und differenzieren, selbst wenn ihre Anzahl in der Peripherie gering ist. So wurde erstmals gezeigt, dass das Tumor-Milieu, nicht aber der Maushintergrund die Häufigkeiten seltener innater Immunzell-Subpopulationen wie pDCs im Tumor definiert
Die endogene CD83 Expression auf Foxp3+ T-Zellen ist essenziell für die Differenzierung und Funktion muriner Foxp3+ regulatorischer Effektor-T-Zellen
No full textFoxp3+ Treg Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Vermittlung der Immun-Homöostase und der Balance des Immunsystems. Nach Aktivierung erhalten Treg Zellen einen Effektor-Status, in dem sie Transkripte exprimieren, die wichtig für ihre suppressiven Kapazitäten sowie für Migration und Überleben sind. Es ist jedoch immer noch nicht genau geklärt, wie verschiedenste Faktoren diesen Differenzierungsprozess kontrollieren. In dieser Arbeit werden erstmals Daten gezeigt, die zeigen, dass die CD83 Expression auf Treg essentiell für deren Differenzierung nach Aktivierung ist. Interessanterweise besitzen diese Treg-spezifischen CD83 cKO Mäuse einen reduzierten Anteil an Foxp3+Treg und einen stärker proinflammatorischen Phänotyp im Vergleich zu WT-Kontrollen. Zudem führt das Fehlen von CD83 auf Treg zu einer reduzierten Expression von Treg-spezifischen Differenzierungsmarkern und induziert ein inflammatorisches Zytokin-Profil. Außerdem zeigen cKO Mäuse eine verstärkte Autoimmunität und eine beeinträchtigte Auflösung der Entzündungsreaktion. Zusammenfassend konnte hier gezeigt werden, dass die CD83 Expression auf Treg für die Entwicklung und Stabilität von aktivierten Effektor-Treg essenziell ist
Epistatic effects of DNase- and Siglec-deficiencies in SLE development, and the nanoscale organization of Siglec-G on the plasma membrane of B cells
No full textSystemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine schwere Autoimmunerkrankung, die weltweit verbreitet ist und vorzugsweise Frauen im gebärfähigen Alter betrifft. SLE ist eine sehr heterogene Krankheit, und auch die Entstehung scheint multifaktoriell zu sein. Die meisten der Gene, die in genom-weiten Assoziationsstudien mit SLE identifiziert wurden, lassen sich drei biologischen Prozessen zuordnen: Abbau von Immunkomplexen, TLR-Funktion mit Produktion von Typ-I-Interferon und Signaltransduktion in Lymphozyten. Derzeit wird versucht, epistatische Effekte von Genen zu identifizieren, die an den genannten biologischen Prozessen beteiligt sind. Daher werden in dieser Arbeit potenzielle epistatische Effekte von Genen untersucht, die am Abbau von DNA (DNase1 und DNase1l3), der Lymphozyten-Signaltransduktion (Siglecg) und der Produktion von Typ-I-Interferon (Siglech) beteiligt sind. DNase1 und DNase1l3 sind Endonukleasen, die DNA abbauen. Es wurde gezeigt, dass sie sowohl im Menschen als auch in der Maus an der Entwicklung von SLE beteiligt sind. Siglec-G ist ein hemmender Rezeptor für die B Zell Rezeptor (BZR)-Signalübertragung in B1a-Zellen. Es wurde gezeigt, dass Siglecg-/- Mäuse SLE-ähnliche Symptome entwickeln, jedoch wurde bisher kein Zusammenhang mit genetischen Polymorphismen oder Mutationen des menschlichen Paralogs SIGLEC10 festgestellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Siglec-H die Produktion von Typ-I-Interferonen durch plasmazytoide dendritische Zellen nach TLR-9-Stimulation in vitro oder nach einer in vivo Infektion mit mCMV hemmt. Bei Siglec-H-defizienten Mäusen wurden leichte SLE-ähnliche Symptome beobachtet. Um die epistatischen Effekte dieser Gene zu untersuchen, wurden doppelt defiziente DNase1-/- x Siglecg-/-, DNase1l3-/- x Siglecg-/- und DNase1l3-/- x Siglech-/- Mäuse durch Kreuzung erzeugt. Bei DNase1-/- x Siglecg-/- Mäusen manifestieren sich die epistatischen Effekte hauptsächlich auf zellulärer Ebene mit einer vermehrten Bildung spontaner Keimzentren. Im Gegensatz dazu zeigen DNase1l3-/- x Siglecg-/- Mäuse erhöhte ANA-Werte und Anti-dsDNA-Antikörper-Titer. Sowohl DNase1-/- x Siglecg-/- als auch DNase1l3-/- x Siglecg-/- Mäuse weisen einen erhöhten Glomerulosklerose-Score auf, der bei Letzteren deutlich höher ist. Des Weiteren sind die meisten Veränderungen bei DNase1l3-/- x Siglech-/- Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen nur tendenziell, aber nicht statistisch signifikant. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination einer DNase-Defizienz mit einer Siglec-G-Defizienz, aber wahrscheinlich nicht mit einer Siglec-H-Defizienz, epistatische Effekte verursacht, die die Entwicklung des SLE beeinflussen.
Neben der Analyse epistatischer Effekte wird in dieser Arbeit untersucht, ob zwei SNPs im SIGLEC10-Gen, die bei SLE-Patienten gefunden wurden, zur Entwicklung von SLE beitragen können. Eine vom Labor von C. Vinuesa durchgeführte Ganzgenomsequenzierung von SLE-Patienten ergab jedoch, dass SIGLEC10 häufig von seltenen Mutationen betroffen ist. Daher werden zwei SNPs in SIGLEC10 auf ihren möglichen Einfluss auf die Hemmung der BZR-Signalübertragung untersucht. Zu diesem Zweck wurde die menschliche B-Zelllinie RAMOS mit lentiviralen Konstrukten transduziert, die entweder wt- oder mutierte SIGLEC10-Inserts enthalten.
Die BZR-Signalübertragung in den transduzierten RAMOS-Zellen wurde dann anhand des Einstroms von Calcium in die Zelle untersucht. Es ist jedoch kein Einfluss der SIGLEC10-SNPs nachweisbar.
Der zweite Teil dieser Arbeit zielt darauf ab, ein besseres Verständnis der Siglec-G-Regulation zu erhalten. Analysen von Siglec-G-defizienten Mäusen zeigten eine B1-Zell-spezifische Funktion von Siglec-G, da Siglecg-/- Mäuse eine erhöhte Anzahl von B1-Zellen in der Milz, eine starke Vermehrung von B1a-Zellen im Peritoneum und eine erhöhte Kalziummobilisierung in B1a-Zellen nach BZR-Stimulation zeigten. Im Gegensatz dazu waren andere B-Zell-Untergruppen nicht beeinträchtigt. Der Mechanismus, der hinter dieser Spezifität für B1a-Zellen steht, bleibt jedoch unklar. In dieser Arbeit wird analysiert, ob eine Siglec-G-Spezifität für B1a-Zellen aus einer unterschiedlichen Organisation und Assoziation mit Immundomänen von Siglec-G auf der Plasmamembran von B-Zellen resultiert. Zu diesem Zweck wurden mögliche Veränderungen in der Verteilung und Organisation von Siglec-G und IgM sowie deren Assoziation mit den beiden „Super-Resolution“-Mikroskopietechniken TIRF & SRRF-Mikroskopie und dSTORM-Mikroskopie untersucht. Die TIRF- und SRRF-Mikroskopie zeigt, dass Siglec-G und IgM bereits auf ruhenden B1a-Zellen stärker kolokalisieren als auf B2-Zellen. Darüber hinaus nimmt die Kolokalisierung auf B1a-Zellen signifikant zu, bleibt aber auf B2-Zellen nach BZR-Stimulation konstant. Darüber hinaus zeigt die TIRF- und SRRF-Mikroskopie eine verminderte Assoziation von Siglec-G und IgM auf B1a-Zellen, aber nicht auf B2-Zellen der Ligandenbindungsmutante Siglec-G-R120E. Daher könnte die Ligandenbindung von Siglec-G wichtig für die Assoziation von Siglec-G und IgM auf B1a-Zellen, aber nicht auf B2-Zellen sein. Ruhende B-Zellen von wt- und Siglec-G-R120E-Mäusen wurden ebenfalls mittels dSTORM-Mikroskopie analysiert. Ein erstes Experiment bestätigte die verstärkte Assoziation von Siglec-G und IgM auf ruhenden B1a-Zellen im Vergleich zu B2-Zellen. Die Auswertung weiterer dSTORM-Mikroskopie-Experimente ist jedoch noch nicht abgeschlossen. Daher kann noch keine endgültige Schlussfolgerung gezogen werden. Zusammenfassend bestätigen die „Super Resolution“-Mikroskopie-Experimente eine erhöhte Assoziation von Siglec-G und IgM auf B1a-Zellen und weisen auf eine erhöhte Abhängigkeit der Siglec-G-Ligandenbindung für die Assoziation mit IgM auf B1a-Zellen hin.Systemic lupus erythematosus (SLE) is a severe autoimmune disease with a worldwide distribution preferably affecting women in childbearing age. SLE is a very heterogenous disease and its origin appears to be multifactorial as well. Most of the genes identified in genome-wide association studies with SLE can be assigned to three biological processes: processing of immune complexes, Toll-like receptors (TLRs) function with production of type I interferon (IFN) and signal transduction in lymphocytes. Current efforts are determined to identify epistatic effects of genes involved in the mentioned biological processes. Therefore, this work investigates potential epistatic effects of genes involved in DNA clearance (DNase1 and DNase1l3), lymphocyte signal transduction (Siglecg) and production of type I IFN (Siglech). DNase1 and DNase1l3 are endonucleases degrading DNA. They have been shown to be involved in SLE development in both humans and mice. Siglec-G is an inhibitory receptor of B cell receptor (BCR) signalling in B1a cells. Siglecg-/- mice have been shown to develop SLE-like symptoms, however, no association of genetic polymorphisms or mutations of the human paralogue SIGLEC10 has been detected so far. Siglec-H was shown to negatively regulate the production of type I IFNs by plasmacytoid dendritic cells after TLR-9 stimulation in vitro, or after an in vivo infection with murine cytomegalovirus. A development of mild SLE-like symptoms could be found in Siglec-H-deficient mice. To investigate epistatic effects of these genes, double-deficient DNase1-/- x Siglecg-/-, DNase1l3-/- x Siglecg-/- and DNase1l3-/- x Siglech-/- mice were generated by crossing. In DNase1-/- x Siglecg-/- mice, epistatic effects mainly manifest on a cellular level with increased formation of spontaneous germinal centers. In contrast, DNase1l3-/- x Siglecg-/- mice show increased ANA levels and anti-dsDNA antibody titers. Both DNase1-/- x Siglecg-/- and DNase1l3-/- x Siglecg-/- mice reveal an enhanced glomerulosclerosis score, considerably higher in the latter. Furthermore, most changes in DNase1l3-/- x Siglech-/- mice are only non-significant tendencies. In summary, the combination of a DNase-deficiency with a Siglec-G-deficiency, but probably not a Siglec-H-deficiency, causes epistatic effects that influence SLE development.
Beside the analysis of epistatic effects, it is investigated in this thesis, whether two SNPs in SIGLEC10 found in SLE patients may contribute to SLE development. Whole-genome sequencing of SLE patients performed by the laboratory of C. Vinuesa revealed SIGLEC10 to be frequently affected by rare mutations. Therefore, two SNPs in SIGLEC10 are analysed for their potential influence on BCR signalling inhibition. For this purpose, the human B cell line RAMOS was transduced with lentiviral constructs containing either wt or mutated SIGLEC10 inserts. BCR signalling in transduced RAMOS cells has then been investigated by a calcium mobilisation assay. However, no influence of the SIGLEC10 SNPs is detectable.
The second part of this theses aims to gain further understanding of Siglec-G regulation. Analyses of Siglec-G-deficient mice revealed a B1 cell-specific function of Siglec-G, as Siglecg-/- mice showed increased numbers of splenic B1 cells, a large expansion of B1a cells in the peritoneal cavity and increased calcium mobilization into B1a cells after BCR stimulation. In contrast, other B cells subsets were unaffected. However, the mechanism behind this specificity for B1a cells remains unclear. This thesis analyses, whether a Siglec-G specificity for B1a cells results from a different nanoscale organization and association with immunodomains of Siglec-G on the plasma membrane of B cells. For this purpose, potential alterations in the distribution and organization of Siglec-G and IgM as well as their association was investigated by the two super-resolution microscopy techniques TIRF & SRRF microscopy and dSTORM microscopy. TIRF & SRRF microscopy reveals that Siglec-G and IgM show increased colocalization on resting B1a cells than B2 cells. Moreover, the colocalization increases significantly on peritoneal B1a cells but remains constant on splenic B2 cells after BCR stimulation. In addition, TIRF & SRRF microscopy shows a decreased association of Siglec-G and IgM on B1a cells, but not B2 cells of the ligand binding mutant Siglec-G-R120E. Therefore, Siglec-G ligand binding might be important for the association of Siglec-G and IgM on B1a cells, but not B2 cells. Resting B cells from wt and Siglec-G-R120E mice were also analysed via dSTORM microscopy. A first experiment confirmed the increased association of Siglec-G and IgM on resting B1a cells compared to B2 cells. However, the analysis of further dSTORM microscopy experiments is still in progress. Therefore, no final conclusion can be drawn yet. In summary, the super-resolution microscopy experiments confirm an elevated association of Siglec-G and IgM on B1a cells and indicate an increased dependency of Siglec-G ligand binding for its association with IgM on B1a cells
Der Einfluss der Siglec-H Defizienz auf die Funktion von plasmazytoiden dendritischen Zellen und Mikroglia
No full textSiglec-H is a murine receptor mainly expressed on plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and microglia. In pDCs it is already known, that the loss of Siglec-H leads to an increased expression of type-I IFNs. Since this induces a severe lupus-like autoimmune disease in a MCMV infection model (dsDNA virus), the question arose whether other virus types would also have an impact on the induction of autoimmunity in Siglec-H ko mice. For that, two infection models were used: Influenza (ssRNA virus) and chronic LCMV (ssRNA virus). In both models the mice did not show any signs of autoimmunity like ANAs, anti-dsDNA autoantibodies or blood urea-nitrogen, several weeks after infection.
Since the deficiency of Siglec-H shows increased amounts of type-I IFN in pDCs after stimulation, it was also important to investigate the impact on the production of type-III IFNs. In stimulation assays of wt and ko pDCs no differences could be found in the expression of the type-III IFN IFNλ showing the specific impact of Siglec-H on the IFN signaling cascade.
Through RNA-sequencing of naive wt and Siglec-H ko pDCs 33 differently expressed genes could be detected. 17 were upregulated and 16 downregulated. Most of them could be also validated through qPCR analysis and one gene (CCR9) additionally through flow cytometry. In correlation with the reduced expression of CCR9, it was also possible to show that Siglec-H ko pDCs display a reduced migration capacity towards the respective chemokine ligand CCL25.
Lastly, two tumor models were used to investigate the role of Siglec-H on pDCs in a tumor environment. B16F10 melanoma cells were injected s.c. or i.v. and the tumor growth and weight were analysed. In both models no differences could be detected between wt and Siglec-H ko recipient mice.
Another part of this dissertation focused on the function of Siglec-H on microglia, since its function is unknown. On the one hand primary microglia were used in an in vitro culture where they were stimulated with LPS, CpG or R848. The gene expression of genes and cytokines like Trem2, Ifnb and Tnfa was analysed via qPCR. Ifnb and Tnfa tended to be increased after stimulation with CpG in Siglec-H ko microglia, which was not significant due to lack of biological replicates. On the other hand, the autoimmune disease model of EAE was used. No differences could be detected in the EAE disease score between wt and ko mice. The amount of Tregs on the peak of disease was also comparable as well as the restimulatory capacity of splenocytes after MOG-treatment. Sorted microglia from this time point showed no differences in the gene expression levels of Trem2, Ifnb, Tnfa and Msr1.Siglec-H ist ein muriner Rezeptor, der hauptsächlich auf plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) und Mikroglia vorkommt. Aus pDCs ist bereits bekannt, dass es bei Verlust von Siglec-H zu einer erhöhten Expression von Typ-I IFN kommt. Da dies bei einer Infektion mit MCMV (dsDNA-Virus) zu einer Lupus-ähnlichen Autoimmunität 26 Wochen nach Infektion führt, sollte im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss anderer Virusarten auf die Entstehung einer Autoimmunerkrankung im Siglec-H ko untersucht werden. Dazu wurden Influenza und LCMV-Virus als Modelle gewählt. Sowohl das akute Infektionsmodell mit Influenza (ssRNA-Virus) als auch das chronische Modell mit LCMV (ssRNA-Virus) lösten keine Anzeichen einer Autoimmunität nach einem Zeitraum von ca. 6 Monaten aus. Es konnten nur geringe Mengen von Autoantikörpern sowie keine Nierenschäden detektiert werden.
Da die Defizienz von Siglec-H eine erhöhte Typ-I IFN Antwort nach Stimulation hervorruft, sollten auch die Auswirkungen auf die Typ-III IFN Produktion in Stimulationsversuchen untersucht werden. Hierbei bestätigte sich der spezifische Einfluss von Siglec-H auf die IFN-I Signalkaskade, da die Produktion des Typ-III IFN IFNλ bei wt und Siglec-H ko gleichblieb.
Des Weiteren konnten mittels RNA-Sequenzierung von naiven wt und ko pDCs insgesamt 33 verändert exprimierte Gene gefunden werden, 17 davon hoch- und 16 davon herunterreguliert. Der Großteil dieser Gen-Expression konnte wiederum mittels qPCR und ein Gen (CCR9) nochmals mittels Durchflusszytometrie validiert werden. Für die reduzierte Expression von CCR9 konnte zudem auch eine Auswirkung auf das Wanderverhalten der pDCs in vitro gezeigt werden.
Zuletzt wurde auch die Rolle von Siglec-H auf pDCs in zwei Tumormodellen untersucht. Hierfür wurden B16F10 Melanomzellen entweder subkutan oder intravenös injiziert und das Tumorwachstum beurteilt. Hierbei gab es in beiden Modellen keine Unterschiede in WT- und Siglec-H ko Mäusen in Tumorwachstum und Gewicht.
Da Siglec-H auch auf Mikroglia exprimiert wird, die Funktion dieses Rezeptors auf diesen Zellen aber noch nicht bekannt ist, wurde im Rahmen dieser Dissertation auch ein zweiter Fokus auf diese Fragestellung gelegt. Um dies zu beantworten, wurden zum einen primäre Mikroglia mit LPS, CpG oder R848 stimuliert und die Genexpression von Trem2, Ifnb und Tnfa mittels qPCR untersucht. Hierbei zeigte sich, dass im Siglec-H ko die Expression von Ifnb und Tnfa tendenziell nach der Stimulation mit CpG erhöht war. Im Krankheitsmodell der EAE waren allerdings keine Unterschiede in der Schwere der Ausprägung festzustellen. Auch zum Höhepunkt der Erkrankung gab es keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Zahl der Tregs und der Restimulierbarkeit der Zellen mit MOG-Peptid in der Milz. Sortierte Mikroglia zeigten an dem Zeitpunkt keine Unterschiede in der Expression der Gene Trem2, Ifnb, Tnfa, Spp1 und Msr1
Analysen des IL-6 Signalweges in HSV-1-infizierten dendritischen Zellen und Charakterisierung von HSV-1- generierten L-Partikeln
No full textDendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, which sentinel in peripheral tissues for invading pathogens and bridge the innate and adaptive immune response. For the activation of antigen-specific T cells and the induction of potent anti-viral immune responses by mature DCs (mDCs), the IL-6 signaling pathway is pivotal. Amongst other viruses, herpes virus type 1 (HSV-1), the prototypic and well-studied member of the α-herpesvirus subfamily, targets the IL-6 signaling pathway.
In the present study we provide evidence that the IL-6 signaling pathway, in particular micro RNA-124 (miR-124), IL-6 receptor α chain (IL6R) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), are strongly modulated in HSV-1-infected mDCs. The miR-124 targets both components of the IL-6 signaling pathway and its expression is highly increased in HSV-1-infected mDCs. In contrast, IL6R surface expression is significantly downmodulated on HSV-1-infected mDCs, leading to an almost complete loss of its expression. The regulation of IL6R expression was also observed on mRNA levels. Interestingly, the IL6R surface expression was not only reduced on directly HSV-1-infected mDCs, but also on bystander mDCs. Mechanistically, our results revealed the viral tegument protein vhs to be responsible for IL6R modulation.
As previously shown, upon an HSV-1 infection of mDCs, predominantly non-infectious light
(L-) particles, lacking the viral capsid genome, are generated and only marginal amounts of mature infectious virions, designated as heavy (H-) particles, are released Interestingly, our experimental data show that these non-infectious L-particles, produced by HSV-1-infected mDCs, were able to modulate IL6R expression on uninfected bystander mDCs. To analyze the viral protein content of L- and H-particles, we performed mass spectrometric analyses and identified 63 viral proteins in L- and H-particles, isolated from HSV-1-infected BHK21 cells. In mDC-derived L-particles 41 viral proteins were present. These data indicate that L-particles contain a plethora of viral proteins, however, mDC-derived L-particles have a unique protein pattern and differ to their counterparts, derived from BHK21 cells. Functional analyses of L particles revealed that these non-infectious particles interfere with the DC phenotype by modulating DC-specific molecules such as the IL6R. Subsequently, this leads to the inhibition of the IL-6 signaling cascade, and thus finally blocks their T cell stimulatory capacity.
Regarding the IL-6 signaling pathway, we show that also the downstream molecule STAT3 was downregulated in HSV-1-infected mDCs on protein as well as mRNA levels. Interestingly, STAT3 protein degradation was proteasome-dependent, but not associated with ubiquitin. Beside the human system, we clearly demonstrate that STAT3 downregulation also occurred in murine DCs, indicating that STAT3 downregulation is specific for DCs. In summary, here we report for the first time that HSV-1 targets the IL-6 signaling pathway to suppress DC-mediated antiviral immune responses.Dendritische Zellen (DZ) patrouillieren in der Peripherie des menschlichen Körpers, um eindringende Krankheitserreger zu erkennen. Mit ihrer einzigartigen Fähigkeit, T-Zell-induzierte Immunantworten zu induzieren, verbinden sie das angeborene mit dem adaptiven Immunsystem. Um naive T-Zellen zu aktivieren und eine antivirale Immunantwort auszulösen, ist der IL-6- Signalweg von zentraler Bedeutung. Wie bereits für andere Viren bekannt ist, moduliert das Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1), ein Mitglied der α-Herpesvirusfamilie, den IL-6-Signalweg.
In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des IL-6-Signalwegs, im Speziellen die microRNA-124 (miR-124), die α-Untereinheit des IL-6-Rezeptors (IL6R) sowie das Molekül zur Signaltransduktion und -aktivierung der Transkription 3 (STAT3), während der HSV-1-Infektion reifer DZ stark moduliert werden. HSV-1 induzierte dabei eine Hochregulation der miR-124, die wiederum sowohl STAT3 als auch den IL6R als Zielgene erkennt. Im Gegensatz dazu war die Oberflächenexpression des IL6R ist auf direkt infizierten, reifen DZ signifikant herunterreguliert und führte im Verlauf der Infektion zu einem nahezu kompletten Verlust der Rezeptoroberflächenexpression. Diese Regulation wurde sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene nachgewiesen. Interessanterweise wurde die Oberflächenexpression des IL6R nicht nur auf direkt infizierten, reifen DZ reduziert, sondern auch auf nicht infizierten Bystander-DZ. Die nachfolgenden Experimente identifizierten das virale Tegumentprotein vhs als einen hauptverantwortlichen Faktor für die IL6R-Modulation.
Während einer HSV-1-Infektion von reifen DZ werden hauptsächlich nicht-infektiöse, leichte (L-) Partikel generiert, die kein virales Kapsid und somit auch keine virale DNA besitzen und nur geringste Mengen an infektiösen reifen Virionen, sogenannte schwere (H-) Partikel. Diesbezüglich konnten wir nachweisen, dass sowohl L-Partikel ausreichend für die IL6R-Modulation waren. Mithilfe massenspektrometrischer Analysen konnten wir 63 virale Proteine in nicht-infektiöser L-Partikel, sowie in und H-Partikeln aus BHK21 Zellen identifizieren. In L Partikeln, die von HSV-1-infizierten, reifen DZ stammten, wurden 41 viral Proteine nachgewiesen. Unsere Ergebnisse machen deutlich, dass eine Vielzahl viraler Proteine in L Partikeln vorhanden ist, allerdings unterscheidet sich die Proteinkomposition zelltypabhängig. Durch weiterführende Analysen wurde gezeigt, dass L-Partikel den Phänotyp reifer DZ unter anderem durch die Modulation der Oberflächenexpression des IL6R verändern. Somit inhibieren L-Partikel ihrer Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren.
In Zusammenhang mit dem IL-6-Signalweg wurde in dieser Arbeit auch die Regulation des intrazellulären Signalmoleküls STAT3, während einer HSV-1-Infektion von reifen DZ, analysiert. STAT3 wurde sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Ebene herunterreguliert. Obwohl der STAT3 Abbau über das Proteasom vermittelt wird, konnte keine Ubiquitinierung von STAT3 nachgewiesen werden. Zusammenfassend, wurden im Rahmen dieser Arbeit Daten erhoben, die erstmals zeigen, dass HSV-1 den IL-6-Signalweg in reifen DZ moduliert, um so eine potente antivirale Immunantwort zu inhibieren
Zielgerichtetes transkriptionelles Ansprechen von Dendritischen Zellen als Ansatz für eine therapeutische Impfung gegen HIV-1
No full textAccording to the World Health Organisation in 2021, more than 38 million people were living with the Human Immunodeficiency Virus (HIV). While antiretroviral therapy (ART) was a breakthrough in preventing progression into the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), there is still no cure available and traditional vaccination attempts have shown limited effects.
More recently, dendritic cell (DC)-based vaccination strategies have sparked interest in controlling HIV infection. Targeting DCs for vaccination is particularly promising as they are extraordinarily potent inducers of strong and broad T cell responses. Currently, most DC vaccination attempts focus on cumbersome and expensive in vitro transduction of cells. Vectors targeting DCs in vivo would facilitate up-scaling and vaccine availability. Achieving these benefits without compromising on safety or risk pathogen tolerance requires new tactics to ensure targeting specifically only mature T cell stimulating DCs (mDCs). To address this challenge, this project aimed to investigate transcriptional targeting utilising the status-specific activity of the CD83 promoter to limit expression of HIV-1 antigens to mature DCs.
We strived to create vectors based on the adenovirus serotype 5 (HAdV-5) that encode for HIV gag, a HIV gene as an antigen source, and a constitutive active variant of the IκB kinase (caIKK), an immune-stimulatory molecule to boost the DC activity. Expression of both those genes was controlled by the CD83 promoter. Before, however, we had to tackle limited transduction efficiency of DCs with HAdV-5. Towards the latter, LentiBOOST®/Polybrene (LeB/PB) significantly improved the transduction rate of human DCs. Additionally, LeB/PB enabled adenoviral transduction of human monocytes and murine bone marrow-derived DCs. Pivotally, cell viability, morphology and function was maintained in all assessed cell types despite exposure to the transduction enhancer.
Next, we used the CD83 promoter to co-express two proteins within the same vector. By cloning the promoter twice into the vector or alternatively introducing an internal ribosomal entry site (IRES) and using fluorescent genes as placeholders, we created two vectors with comparable protein expression levels that provided the basis for the generation of HAdV-5 vectors for potential future use as vaccines: HAdV-5-IRES-gag-caIKK and HAdV-5-2xP-gag-caIKK (containing the CD83 promoter twice). qPCR confirmed protein expression to be restricted to mature DCs. DCs transduced with both viral vectors stimulated autologous T cell activity independently of the expression of antigen-specific T cells, as was demonstrated by upregulation of CD69 and increased production of pro-inflammatory cytokines including IL-6, IL-8, IL-12p70, and in addition IL-10. These results provide the basis in order to use the CD83 promoter to develop DC-based gene therapy against HIV-1.Im Jahr 2021 lebten nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation mehr als 38 Millionen Menschen mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). Während antiretrovirale Therapie ein Durchbruch für die Prävention des Fortschreitens der Erkrankung hin zum Erworbenen Immunschwäche-Synrom (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) war, ist eine Heilung noch immer nur in Einzelfällen möglich und herkömmliche Impfversuche zeigen bislang nur begrenzt Wirkung.
Impfstrategien gegen HIV-1 auf der Grundlage dendritischer Zellen (DCs) sorgten in den letzten Jahren vermehrt für Aufmerksamkeit. DC-basierte Impfstrategien gelten als vielversprechend, da sie außergewöhnlich starke und vielfältige T-Zell-Reaktionen auslösen können. Die meisten DC-Impfversuche setzen derzeit auf eine umständliche und teure in-vitro-Transduktion von Zellen, obwohl in vivo-einsetzbare Vektoren die Anwendung und Verfügbarkeit des Impfstoffs vereinfachen könnten. Um diese Vorteile zu erreichen, ohne die Sicherheit zu beeinträchtigen oder die Toleranz gegenüber Krankheitserregern zu riskieren, sind neue Taktiken erforderlich, die sicherstellen, dass ausschließlich reife DCs Antigene präsentieren. Dementsprechend wurde in diesem Projekt das transkriptionelle Targeting untersucht, um die Expression von HIV-1-Antigenen mit Hilfe der stadiums-spezifischen Aktivität des CD83-Promotors auf reife DCs zu beschränken.
Adenovirus-Serotyp-5 (HAdV-5)-basierende Vektoren wurden entwickelt, die HIV gag als Antigen-Quelle und eine konstitutiv aktive Variante der IκB-Kinase (caIKK) als immunstimulierendes Molekül zur Steigerung der DC-Aktivität kodieren. Die Expression dieser beiden Gene wird durch den CD83-Promotor gesteuert. Mit LentiBOOST®/Polybrene (LeB/PB) konnte die Transduktionsrate humaner DCs mit HAdV-5-Vektoren deutlich verbessert werden. Außerdem ermöglichte LeB/PB die adenovirale Transduktion von humanen Monozyten und murinen DCs, ohne Viabilität, Morphologie und Funktion der Zellen einzuschränken.
Die gleichzeitige Expression zweier Proteine unter der Kontrolle des CD83 Promoters gelang mit Hilfe einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) oder durch zweifaches Einsetzen des Promotors. Fluoreszierende Proteine als Platzhalter für HIV-1 gag und caIKK demonstrierten ähnliche Level der Proteinexpression für beide Vektoren. Darauf basierend wurden Vektoren entwickelt, die die Grundlage für die Erzeugung von HAdV-5-Vektoren für eine mögliche zukünftige Verwendung als Impfstoffe bilden: HAdV-5-IRES-gag-caIKK und HAdV-5-2xP-gag-caIKK (mit zweimaligem CD83-Promotor). Die Restriktion der Genexpression auf reife DCs wurde mittles qPCR bestätigt. DCs, die mit einem der beiden viralen Vektoren transduziert wurden, stimulierten die Aktivität autologer T-Zellen unabhängig von der Expression antigenspezifischer T-Zellen. Dies wurde durch die Hochregulierung von CD69 und die erhöhte Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-6, IL-8, IL-12p70 und IL-10 nachgewiesen. Diese Ergebnisse stellen die Basis zur Nutzung des CD83-Promotors für die Entwicklung einer DC-basierten Gentherapie gegen HIV-1 dar
Expression des CD83 Moleküls durch Makrophagen und seine Rolle auf Mikroglia im Zusammenhang mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis
No full textThe CD83 molecule possesses robust immunomodulatory properties, with numerous investigations underscoring its importance as a critical checkpoint in the resolution of inflammation. Membrane-bound CD83 (mCD83) has been characterized as an activation marker for dendritic cells (DCs) but it is also expressed on various other immune cell types, including regulatory T cells, thymic epithelial cells, B cells, and macrophages (MΦ). Several studies also reported expression of CD83 within microglia of the central nervous system (CNS), where it is associated with distinct cellular phenotypes.
In accordance with findings in other immune cell populations, the absence of CD83 results in heightened pro-inflammatory activity in murine MΦ, indicating an important role in determining the pro-resolving polarization of these cells. However, the expression kinetics of CD83 following the activation of bone marrow-derived macrophages (BMDM) with lipopolysaccharide (LPS) remained unexplored. Furthermore, the spatial distribution of microglial CD83 as well as its regulation and relevance for cellular functions have not been described until now. Thus, the aims of this thesis were (i) to decipher the regulation of intracellular trafficking of CD83 in LPS-activated BMDM as well as (ii) the molecule’s spatial expression and biological function in microglia during homeostasis and inflammation.
Within the first aim of this thesis we elucidated the expression kinetics and characterized the trafficking of CD83 subsequent to LPS-induced activation of BMDM. Herein, we report a rapid, but temporary expression of CD83 on BMDM between one and six hours after LPS stimulation. Additionally, we observed that CD83 expression in BMDM preceded the early activation antigen CD69 and other macrophage polarization markers. This increase in CD83 expression thus represents an immediate-early response, indicating its pivotal role in dictating cellular fate. Through pharmacological inhibition we delineated the intracellular trafficking of CD83 in LPS-activated BMDM which comprises: (i) a remarkably rapid de novo synthesis of the protein, (ii) trafficking through the Golgi apparatus and extensive glycosylation, (iii) a hitherto unreported dynamin-dependent endocytosis mechanism of CD83 from the surface of BMDM, followed by (iv) the lysosomal degradation of the protein.
Regarding the regulation and function of CD83 in microglia, which was the second aim of this thesis, we elucidated the kinetics of CD83 expression following the inflammatory activation of microglia. We demonstrated a remarkable similarity to CD83 expression kinetics in LPS-activated BMDM, suggesting a potential analogous regulatory mechanism for CD83 expression across different macrophage lineages. Additionally, we assessed the spatial distribution of CD83 on microglial cells under conditions of both homeostasis and disease, unveiling an elevated expression of CD83 in the caudal, white matter-rich regions of the cerebellum and spinal cord. While investigating the spatial distribution of CD83 during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the murine model for multiple sclerosis (MS), we observed a sustained expression of Cd83, which is associated with a pro-resolving phenotype in these cells. Employing a CD83 conditional knock-out in microglia (CD83ΔMG) and single-cell RNA sequencing, we identified an exacerbated pro-inflammatory activation of microglia derived from CD83ΔMG mice, as evidenced by their increased propensity to associate with a cluster exhibiting elevated expression of microglial activation markers (i.e. Cd74, Apoe, Cst7, Ctsb, Lilrb4, and Eef1a1) during EAE. Conversely, microglia derived from control mice (CD83wtCre) mice retained a more homeostatic phenotype characterized by the expression of Csmd3, Cst3, P2ry12, Siglech, and Gpr34. Additionally, we reported a more pronounced expression of genes involved in the activation of antigen-presenting cells and leukocyte-mediated immunity in CD83ΔMG microglia. In contrast, Cd83 expression in microglia during EAE correlated with genes implicated in negative regulation of the response to external stimuli and immune system regulation. Taken together, our findings demonstrate that, similar to its effects on other immune cell types, the depletion of CD83 in microglia results in heightened pro-inflammatory responses and compromised resolution of inflammation in degenerative disorders associated with this specific cell lineage. Thus, CD83 expression in microglia serves not only as a marker of cellular activation but also signifies its pivotal role as a regulatory molecule in dampening neuroinflammatory processes.
Throughout the second aim of this thesis, we have substantiated that CD83 expression on microglia operates as a regulator of cellular activation. Furthermore, microglial cells emerge as the primary CD83-expressing entities within the central nervous system. A soluble isoform of CD83 (sCD83) exhibited proven potent immune-modulatory capabilities across multiple in vivo models and increased serum levels were found in patients diagnosed with rheumatoid arthritis and hematological malignancies. Consequently, the third aim of this dissertation entailed the evaluation of sCD83 levels in both serum and cerebrospinal fluid of patients with MS. We hereby unveiled a remarkable correlation between both patient age and gender, and the secretion of sCD83 into the cerebrospinal fluid. Furthermore, we reported that administering glucocorticoids to patients with relapsing-remitting MS significantly augmented sCD83 concentration in their cerebrospinal fluid. We thereby elucidated a hitherto unreported positive impact of immune-modulatory treatment on sCD83 levels in individuals with autoimmune disorders.Das Molekül CD83 besitzt robuste, immunmodulatorische Eigenschaften und zahlreiche Untersuchungen konnten seine Bedeutung als entscheidenden Kontrollpunkt bei der Auflösung von Entzündungen verdeutlichen. Das membrangebundene CD83 (mCD83) wurde ursprünglich zwar als Aktivierungsmarker für dendritische Zellen (DZ) charakterisiert, ist jedoch auch auf verschiedenen anderen Immunzelltypen vorhanden, einschließlich regulatorischer T-Zellen, thymischer epithelialer Zellen, B-Zellen und Makrophagen (MΦ). Mehrere Studien berichteten auch über die Expression von CD83 in Mikroglia des zentralen Nervensystems (ZNS), wo es mit verschiedenen zellulären Phänotypen in Verbindung gebracht wird.
In Übereinstimmung mit Befunden in anderen Immunzellpopulationen führte das Fehlen von CD83 zu einer erhöhten pro-inflammatorischen Aktivität in murinen MΦ, was auf eine wichtige Rolle von CD83 in der Entzündungs-auflösenden Polarisation dieser Zellen hinweist. Die Expressionskinetik von CD83 nach der Aktivierung von aus dem Knochenmark generierten Makrophagen (BMDM) mit Lipopolysaccharid (LPS) blieb jedoch unerforscht. Darüber hinaus wurden die räumliche Verteilung von mikroglialem CD83 sowie dessen Regulation und Relevanz für zelluläre Funktionen bisher nicht beschrieben. Daher waren die Ziele dieser Arbeit, erstens die Regulation des intrazellulären Transports von CD83 in LPS-aktivierten BMDM, sowie zweitens die räumliche Expression und biologische Funktion der CD83 Expression in Mikroglia während der Homöostase und Entzündung zu entschlüsseln.
Im Rahmen des ersten Ziels dieser Arbeit haben wir die CD83-Expressionskinetik und den Transport von CD83 nach der LPS-induzierten Aktivierung von BMDM charakterisiert. Hierbei stellten wir eine schnelle, aber transiente Expression von CD83 auf BMDM zwischen einer und sechs Stunden nach LPS-Stimulation fest. Zusätzlich beobachteten wir, dass die CD83-Expression in BMDM der Expression des frühen Aktivierungsantigen CD69 und anderen Polarisationsmarkern von MΦ vorausgeht. Diese Zunahme der CD83-Expression stellt somit eine sofortige Antwort auf die LPS-Stimulation dar, die auf ihre entscheidende Rolle bei der Bestimmung des zellulären Schicksals hinweist. Durch pharmakologische Hemmung haben wir den intrazellulären Transport von CD83 in LPS-aktivierten BMDM aufgeschlüsselt. Dieser umfasst 1. eine bemerkenswert schnelle de-novo-Synthese des Proteins, 2. den Transport durch den Golgi-Apparat und eine umfangreiche Glykosylierung sowie 3, einen bislang – für CD83 – unbekannten, Dynamin-abhängigen Endozytosemechanismus von der Oberfläche von BMDM und 4. den lysosomalen Abbau des Proteins.
Hinsichtlich der Regulation und Funktion der CD83 Expression in Mikroglia, deren Erörterung das zweite Ziel dieser Arbeit waren, haben wir die Kinetik der CD83-Expression nach der entzündlichen Aktivierung von Mikroglia aufgeklärt. Wir enthüllten eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit der CD83-Expressionskinetik in LPS-aktivierten BMDM, was auf potenziell analoge, regulatorische Mechanismen für die CD83-Expression in verschiedenen Makrophagen-Linien hindeutet. Darüber hinaus haben wir die räumliche Verteilung von CD83 auf Mikrogliazellen während Homöostase und Krankheit analysiert und dabei eine erhöhte Expression von CD83 in den kaudalen, weißen Substanz-reichen Regionen des Kleinhirns und des Rückenmarks festgestellt. Bei der Untersuchung der räumlichen Verteilung von CD83 während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), dem murinen Modell für Multiple Sklerose (MS), beobachteten wir eine anhaltende Expression von Cd83, die mit einem immun-auflösenden Phänotyp in diesen Zellen assoziiert ist. Mittels konditionalem CD83-Knockout in Mikroglia (CD83ΔMG) und der Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifizierten wir eine verstärkte proinflammatorische Aktivierung von CD83ΔMG Mikroglia. Dies wurde durch ihre verstärkte Assoziation mit einem Cluster, der eine erhöhte Expression von Mikroglia-Aktivierungsmarkern (z. B. Cd74, Apoe, Cst7, Ctsb, Lilrb4 und Eef1a1) während der EAE aufweist, belegt. Im Gegensatz dazu behielten Mikroglia, die von Kontrollmäusen (CD83wtCre) stammen, einen homöostatischen Phänotyp bei, der durch die Expression von Csmd3, Cst3, P2ry12, Siglech und Gpr34 gekennzeichnet ist. Darüber hinaus identifizierten wir in CD83ΔMG-Mikroglia eine ausgeprägte Expression von Genen, die an der Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen und der leukozytären Immunität beteiligt sind. Im Gegensatz dazu korrelierte die Cd83-Expression in Mikroglia während der EAE mit Transkripten, die an der negativen Regulation der Immunantwort auf externe Reize beteiligt sind. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Depletion von CD83 in Mikroglia, ähnlich wie bei anderen Immunzelltypen, zu verstärkten pro-inflammatorischen Reaktionen und einer beeinträchtigten Auflösung von Entzündungen führt. Somit dient die CD83-Expression in Mikroglia nicht nur als Marker für die zelluläre Aktivierung, sondern nimmt auch eine entscheidende Rolle bei der Regulation neuro-inflammatorischer Prozesse ein.
In Vorarbeiten unserer Abteilung wurde darüber hinaus gezeigt, dass die lösliche Isoform von CD83 (sCD83) sowohl in vitro als auch in vivo starke immunmodulatorische Fähigkeiten besitzt. Außerdem konnten bereits in der Vergangenheit erhöhte sCD83-Serumspiegel bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und hämatologischen Malignitäten nachgewiesen werden. Folglich umfasste das dritte Ziel dieser Dissertation die Analyse der sCD83 Konzentration sowohl im Serum als auch im Liquor von MS-Patienten. Hierbei stellten wir eine bemerkenswerte Korrelation zwischen Patientenalter und dem Geschlecht, sowie der Sekretion von sCD83 in den Liquor fest. Darüber hinaus führte die Behandlung von Patienten mit schubförmig-remittierender MS mit Glukokortikoiden, zu einer signifikant erhöhten sCD83-Konzentration im Liquor. Wir haben somit einen bislang unbekannten, positiven Einfluss des sCD83 Moleküls bei MS Patienten entdeckt
Expression of CD83 in tissue-resident regulatory T cells maintains local homeostasis and restricts effector cells in allergic asthma
No full textNon-lymphoid tissue Tregs (NLT-Tregs) are critical for tissue homeostasis, inflammation control, and induction of mucosal repair. Recent single-cell RNA sequencing data identified expression of CD83 as part of a NLT-Treg signature, however its biological significance for this specialized Tregs was not yet fully understood. In our previous investigations, we found that conditional deletion of CD83 (CD83cKO) disrupts stability and differentiation of lymphoid Tregs and exacerbates autoimmune responses. The present study explores for the first time the role of CD83 expression by lung-resident Tregs to understand its importance in barrier tissues. We report that CD83-deficient lung Tregs are less differentiated but more activated, resulting in unrestrained T cell activation. Furthermore, using an allergic asthma model, CD83cKO mice showed an accelerated disease progression, with augmented eosinophilic inflammation, driven by Th2-biased T cell responses. CD83cKO Tregs exhibited an enhanced responsiveness to IL-4, leading to insufficient control of Th2-differentiation from naïve T cells. These findings underscore the pivotal role of CD83 in the NLT-Treg-mediated modulation of inflammation, especially in the context of Th2 responses. Overall, our results highlight CD83 as a key player in maintaining tissue homeostasis and modulating inflammatory responses, suggesting potential therapeutic implications for inflammatory disorders such as asthma.
Nicht-lymphoide Gewebe-Tregs (NLT-Tregs) sind entscheidend für die Gewebshomöostase, die Entzündungskontrolle und die Induktion der Schleimhautreparatur. Aktuelle Daten aus der Einzelzell-RNA-Sequenzierung haben die Expression von CD83 als Teil einer NLT-Treg-Signatur identifiziert, ihre biologische Bedeutung für diese spezialisierten Tregs war jedoch noch nicht vollständig geklärt. In unseren früheren Untersuchungen haben wir festgestellt, dass die konditionale Deletion von CD83 (CD83cKO) die Stabilität und Differenzierung von lymphoiden Tregs stört und Autoimmunreaktionen verschlechtert. In der vorliegenden Studie wird zum ersten Mal die Rolle der CD83-Expression durch lungenresidente Tregs untersucht, um ihre Bedeutung in Barrieregeweben zu verstehen. Wir berichten, dass CD83-defiziente Lungen-Tregs weniger differenziert, aber stärker aktiviert sind, was zu einer unkontrollierten T-Zell-Aktivierung führt. In einem Modell für allergisches Asthma zeigten CD83cKO-Mäuse außerdem einen verstärkten Krankheitsverlauf mit einer erhöhten eosinophilen Entzündung, die durch Th2-gerichtete T-Zell-Reaktionen ausgelöst wurde. CD83cKO-Tregs reagierten verstärkt auf IL-4, was zu einer unzureichenden Kontrolle der Th2-Differenzierung von naiven T-Zellen führte. Diese Ergebnisse unterstreichen die zentrale Rolle von CD83 bei der NLT-Treg-vermittelten Modulation von Entzündungen, insbesondere im Kontext von Th2-Reaktionen. Insgesamt heben unsere Ergebnisse CD83 als Schlüsselfaktor für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase und die Modulation von Entzündungsreaktionen hervor, was potenzielle therapeutische Auswirkungen auf entzündliche Erkrankungen wie Asthma zur Folge haben könnte
Die Rolle des Aryl-Hydrocarbyl-Rezeptors bei der Induktion tolerogener dendritischer Zellen
No full textDendritic cells (DCs) are key components of the innate immune system, essential for bridging the innate and adaptive immunity. They present antigens to T cells to initiate adaptive responses and facilitate B cell activation in humoral immunity. Depending on factors such as the local microenvironment, cytokine milieu and specific signals from pathogens or host cells, DCs can exhibit either activatory or tolerogenic functions. Activatory DCs stimulate strong immune responses by activating effector T cells and producing pro-inflammatory cytokines, whereas tolerogenic DCs promote immune tolerance through the development of regulatory T cells and the secretion of anti-inflammatory cytokines. Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a transcription factor that is activated by ligand binding and significantly influences DC function. AhR activation in DCs can lead to either activatory or tolerogenic effects, influenced by factors such as ligand properties (size, concentration), organ-specific contexts and species-specific variations. Given that DCs are in constant contact with AhR ligands in their environment, it is crucial to investigate how AhR activation affects DC phenotype and function.
The primary aim of this study was to investigate how AhR activation affects human monocyte-derived dendritic cells (hMoDCs) at a phenotypic and functional level. Using cell culture, qPCR (quantitative PCR) and flow cytometry, we investigated the effects of three AhR ligands - benzo[a]pyrene (BP), 6-formylindolo[3,2-b]carbazole (FICZ) and indoxyl-3-sulphate (I3S) - on hMoDCs. Our results showed that all three ligands activated AhR in hMoDCs, as indicated by increased expression of AhR-induced transcripts (CYP1A1, CYP1B1, AHRR). We then assessed changes in DC phenotype, including alterations in activation and co-stimulatory markers (CD25, CD80, CD83, CD86, MHCII). CD80 and CD83 were significantly downregulated, while CD25 was upregulated to varying degrees depending on the ligand, suggesting a trend towards a tolerogenic phenotype. Further investigation revealed increased levels of negative regulators associated with tolerogenic DCs, such as immunoglobulin-like transcripts (ILTs) and ectonucleotidases (CD39, CD73), particularly in BP-treated cells. Functionally, BP-treated DCs downregulated CCR7 expression and migration capacity, and reduced T cell proliferation while promoting regulatory T cell differentiation. Using CRISPR/Cas9 technology, we confirmed that these effects were AhR-dependent and in the absence of the AhR, neither expression of AhR-induced transcripts nor changes in DC surface markers are seen.
In addition, we performed a murine study using the Cre-lox system to generate AhR knockout mice specifically in CD11c+ cells (AhRΔDC). Bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) from these mice were exposed to AhR ligands (BP, FICZ and I3S) and showed no changes in activation and co-stimulatory markers, except for downregulation of the DC marker CD11c compared to AhRfl/fl. Despite the induction of AhR transcripts by BP and FICZ in BMDCs, the intensity was lower compared to hMoDCs, which may be due to species-specific effects, especially in the case of tryptophan-derived metabolites. The low level of AhR induced transcripts in AhRfl/fl and AhRΔDC mice can be attributed to the presence of Ahrd allele in them. Analysis of immune cell distribution in AhRΔDC mice revealed an altered frequency of DCs, particularly reduced in lymphoid organs, while no differences were seen in the frequency of DCs in adipose tissue. Other immune cells examined also showed no changes in both lymphoid and non-lymphoid organs.
In conclusion, this study highlights the critical role of AhR in DC function, which could open new therapeutic strategies, particularly in relation to autoimmune diseases. These results, particularly the comparison between the mouse and human systems, also highlight the importance of considering species-specific factors and ligand properties, when studying the role of AhR in DCs and how this may ultimately affect the immune response
A Tribute to Robert (Bob) Sim—Personal Memories of Working in Bob’s Lab
No full textThis article is intended as a tribute to Robert B. Sim through the sharing of personal memories and anecdotes from two of Bob’s lab members who worked in his lab between 1989 to 1994
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