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The cytotoxic lymphocyte protease, granzyme B, targets the cytoskeleton and perturbs microtubule polymerization dynamics
No full textGranzyme B, a serine protease derived from cytotoxic T lymphocyte (CTL) and Natural Killer (NK) cell granules, plays an important role in coordinating apoptosis of CTL and NK target cells. Here, we report that granzyme B targets the cytoskeleton by cleaving and removing the acidic C-terminal tail of alpha-tubulin. Consistent with this, Granzyme B markedly enhanced rates of microtubule polymerization in vitro, most likely by removal of an autoinhibitory domain within the tubulin C terminus. Moreover, delivery of Granzyme B into HeLa target cells promoted dramatic reorganization of the microtubule network in a caspase-independent manner. These data reveal that granzyme B directly attacks a major component of the cell cytoskeleton, which may contribute to the incapacitation of target cells during CTL/NK-mediated killing
Role of the metalloprotease ADAM17 in metabolic regulation
No full text"Some signaling molecules and/or their receptors are secreted as membrane- bound proteins. Most of these ligands require the cleavage, also known as “shedding” of their ectodomain by proteases to release their soluble and active forms to mediate autocrine, paracrine, and sometimes endocrine forms of signaling. Shedding ectodomains of transmembrane receptors, dampen signaling or promote non-canonical signaling via the soluble forms of these receptors. An important protease is ADAM17, it belongs to the ADAM family of metalloproteases known earlier for its role in cell adhesion but more recently as the protease important in inflammation via its regulation of the bioavailability of soluble tumor necrosis factor α (TNFα) and its receptors, TNFRI & TNFRII. ADAM17 also sheds the ectodomain of most of the ligands for epidermal growth factor receptor (EGFR), a signaling pathway important in development and growth, and implicated in some cancers. At least 80 other substrates of ADAM17 have been identified. As a result of the plethora of substrates cleaved by ADAM17, it is involved in the regulation of several biological processes in health and disorders such as obesity. Obesity, a state of positive energy balance is associated with chronic inflammation of adipose tissues and ADAM17 is thought to play an important role in this as a result of its role in inflammation. Mice null for ADAM17 are protected from obesity and its associated comorbidities by increasing energy expenditure, a phenotype that cannot be explained only by its role in modulating inflammation. It is therefore important to understand the contribution of ADAM17 within different tissue compartments to the metabolically beneficial phenotypes resulting from ADAM17 inactivation, the substrate(s) of ADAM17 involved, and the mechanism(s) of action. (...)
Role for CED-9 and Egl-1 as regulators of mitochondrial fission and fusion dynamics
No full textBcl-2 family proteins play central roles in apoptosis by regulating the release of mitochondrial intermembrane space proteins such as cytochrome c. Death-promoting Bcl-2 family members, such as Bax, can promote cytochrome c release and fragmentation of the mitochondrial network, whereas apoptosis-inhibitory members, such as Bcl-2 and Bcl-xL, can antagonize these events. It remains unclear whether CED-9, the worm Bcl-2 relative, can regulate mitochondrial fission/fusion dynamics or the release of proteins from the mitochondrial intermembrane space. Here, we show that CED-9 interacts with Mitofusin-2/fuzzy onions and can promote mitochondrial clustering and dramatic reorganization of mitochondrial networks. Consistent with its ability to neutralize CED-9 function, EGL-1 antagonized CED-9-dependent remodeling of the mitochondrial network. However, CED-9 failed to inhibit mitochondrial cytochrome c release or apoptosis induced by diverse triggers in mammalian cells. These data suggest that the ability to regulate mitochondrial fission/fusion dynamics is an evolutionarily conserved property of the Bcl-2 family
Role of RHBDD2 in membrane trafficking regulation
No full textTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015RHBDD2 é parcialmente relacionada com romboides, protéases intra-membranares que degradam substratos na via secretora. Curiosamente, um subgrupo da família romboide, incluindo a RHBDD2, não tem resíduos catalíticos essenciais. Estas “pseudo-proteases” são conservadas, o que implica uma pressão seletiva para manter a sua função durante a evolução. Recentemente, uma mutação pontual (R85H) foi identificada no gene humano que codifica para a proteína RHBDD2, e está associada a uma doença neuro-degenerativa chamada Retinitis Pigmentosa (RP). Esta mutação pontual de G para A, alterou o aminoácido codificado de arginina para histidina no códão 85 do Segundo exão. No entanto a relevância fisiológica da RHBDD2 e a sua contribuição para a doença acima referida não é clara. Os dois maiores focos deste estudo foram (1) a investigação de como a mutação R85H na RHBDD2 contribui para a doença a nível celular; (2) investigar a função da RHBDD2 nativa a nível da célula e do organismo. Vários programas de alinhamento (ClustalO, muscle, tcoffee ferramentas de alinhamento) foram usados para prever a topologia da RHBDD2. Com base na comparação com outros membros da superfamília romboide, os domínios transmembranares (TMD) da RHBDD2 foram previstos. Após identificar cuidadosamente todos os aminoácidos chave nos alinhamentos, eu previ que a RHBDD2 é uma proteína transmembranar com 6 TMD, com ambas as terminações N- e C- presentes na face citoplasmática. Devido ao conhecimento prévio de que a RHBDD2 é expressa em níveis elevados na retina, consistente com a expressão a nível do mRNA na base de dados bioGPS, células de ratinho RPE foram selecionadas como materiais essenciais para as seguintes experiências. Plasmídeos para a sobre-expressão da RHBDD2 WT e da mutação R85H com uma tag de HA no C-terminal foram gerados no vector pLEX MCS, e usados para gerar células estáveis por transdução lentiviral. Estas linhas celulares juntamente com a linha celular com o vector vazio (EV) foram usadas para investigar a função da RHBDD2 a nível bioquímico e da biologia celular. Surpreendentemente, a expressão da forma mutante da RHBDD2 em células RPE, não induziu um stress constitutivo do retículo endoplasmático (RE). Não houce degradação da proteína mutante na linha celular R85H. Isto permitiu-me propor de forma preliminar, que o fenótipo da mutação R85H não é causado por stress do (RE). Por forma a analisar a localização do Et e mutante R85H, células RPE foram marcadas com um anticorpo anti-HA (para detectar RHBDD2 WT e mutante R85H) e com o marcador de stress do RE Calreticulin ou o marcador do cis-Golgi GM130. Imagens de imuno-fluorescência e co-localização mostraram que tanto a WT como a mutante RHBDD2 localizam predominantemente no aparelho de Golgi. Indicando que a mutante R85H localiza-se no mesmo compartimento celular que a proteína nativa, sugerindo que o fenótipo da doença não é causado por stress do RE ou por falta de folding da proteína. Ratinhos com deleção genética (KO) na RHBDD2 foram gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 para definir a função da RHBDD2 e o fenótipo dos animais mutantes. Infelizmente, 5 animais fundadores morreram no primeiro dia de vida. Analise do tecido revelou que dois deles tinham INDELs e três deles eram nativos. Logo, a morte dos animais é pouco provável estar relacionada com o genótipo RHBDD2. A experiência foi repetida e 17 potencias fundadores foram obtidos. Resultados de sequênciaçao indicaram que dois animais fundadores tinham a mutação desejada, provavelmente como quimeras. Identificamos também animais fundadores com INDELs de 6 e 9 pares de bases. Experiências de imuno-precepitação acopladas a espectrometria de massa foram realizadas para identificar novos interactores da RHBDD2. Três IPs foram efetuados em diferentes condições (com ou sem crosslinker, acoplado com diferentes tampões de lavagem). Golgins (GM160, Golgin-84, Golgin-45), que atuam como plataformas de acoplamento membranar, foram co-immuno-precepitadas coma RHBDD2 em ambas as experiências com cross-linker, indicando que a RHBDD2 pode ter um papel na manutenção da estrutura do aparelho de Golgi. Componentes chaves das vesículas COPII foram também capturados nos IPs crosslinked e não crosslinked, indicando que a RHBDD2 pode contribuir para o transporte ER para Golgi dependente de COPII. Estes dois grupos apareceram tanto nos IPs da proteína RHBDD2 nativa como mutante R85H. De notar, o número total de identificações de peptídeos está diminuído em IPs de R85H em condições de crosslinking ou na sua ausência, indicando talvez que o mutante R85H, exibe uma alteração conformacional que resulta numa mudança de repertório de interactores. De acordo com as IPs, experiências de fragmentação do Golgi e da sua reorganização, foram efectuadas com RNA de interferência curto (siRNA) para fazer a atenuação da expressão (KD) de RHBDD2 em células HeLa. /2 horas após a transfecçao, as células foram tratadas com BFA, e depois a droga foi removida do meio. De seguida, as células foram fixadas a diferentes pontos de incubação. Esta experiência não resultou em nenhuma diferença óbvia, na cinética de da morfologia do aparelho de Golgi entre as células tratadas control ou com o KD, mas é importante notar que o siRNA não promove a atenuçao complete da expressão da RHBDD2, logo a presença de alguma RHBDD2 residual pode ter prevenido a observação de um fenótipo mais marcado. O papel fisiológico da RHBDD2 permanece desconhecido. Considerando os possíveis parceiros de ligação da RHBDD2 e a localização da RHBDD2, eu proponho que trabalho future se deva focar no teste do tráfego celular e da glicosilação em células sem expressão de RHBDD2 (KO). Também seria útil gerar um mutante R85H endógeno nas células RPE para avaliar a patologia da mutação, e claro, para avaliar o fenótipo dos ratinhos mutantes
The molecular and organismal role of the EMC
Full text link"Integral membrane proteins (IMPs) comprise approximately
30% of the eukaryotic proteome and confer many essential
functions to biological membranes. These proteins contain
hydrophobic transmembrane domains (TMDs), which mainly
populate the plasma membrane and the intracellular compartments
of the secretory and endocytic pathways.(...)
Role of RHBDD2 in membrane trafficking regulation
No full textTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015RHBDD2 é parcialmente relacionada com romboides, protéases intra-membranares que degradam substratos na via secretora. Curiosamente, um subgrupo da família romboide, incluindo a RHBDD2, não tem resíduos catalíticos essenciais. Estas “pseudo-proteases” são conservadas, o que implica uma pressão seletiva para manter a sua função durante a evolução. Recentemente, uma mutação pontual (R85H) foi identificada no gene humano que codifica para a proteína RHBDD2, e está associada a uma doença neuro-degenerativa chamada Retinitis Pigmentosa (RP). Esta mutação pontual de G para A, alterou o aminoácido codificado de arginina para histidina no códão 85 do Segundo exão. No entanto a relevância fisiológica da RHBDD2 e a sua contribuição para a doença acima referida não é clara. Os dois maiores focos deste estudo foram (1) a investigação de como a mutação R85H na RHBDD2 contribui para a doença a nível celular; (2) investigar a função da RHBDD2 nativa a nível da célula e do organismo. Vários programas de alinhamento (ClustalO, muscle, tcoffee ferramentas de alinhamento) foram usados para prever a topologia da RHBDD2. Com base na comparação com outros membros da superfamília romboide, os domínios transmembranares (TMD) da RHBDD2 foram previstos. Após identificar cuidadosamente todos os aminoácidos chave nos alinhamentos, eu previ que a RHBDD2 é uma proteína transmembranar com 6 TMD, com ambas as terminações N- e C- presentes na face citoplasmática. Devido ao conhecimento prévio de que a RHBDD2 é expressa em níveis elevados na retina, consistente com a expressão a nível do mRNA na base de dados bioGPS, células de ratinho RPE foram selecionadas como materiais essenciais para as seguintes experiências. Plasmídeos para a sobre-expressão da RHBDD2 WT e da mutação R85H com uma tag de HA no C-terminal foram gerados no vector pLEX MCS, e usados para gerar células estáveis por transdução lentiviral. Estas linhas celulares juntamente com a linha celular com o vector vazio (EV) foram usadas para investigar a função da RHBDD2 a nível bioquímico e da biologia celular. Surpreendentemente, a expressão da forma mutante da RHBDD2 em células RPE, não induziu um stress constitutivo do retículo endoplasmático (RE). Não houce degradação da proteína mutante na linha celular R85H. Isto permitiu-me propor de forma preliminar, que o fenótipo da mutação R85H não é causado por stress do (RE). Por forma a analisar a localização do Et e mutante R85H, células RPE foram marcadas com um anticorpo anti-HA (para detectar RHBDD2 WT e mutante R85H) e com o marcador de stress do RE Calreticulin ou o marcador do cis-Golgi GM130. Imagens de imuno-fluorescência e co-localização mostraram que tanto a WT como a mutante RHBDD2 localizam predominantemente no aparelho de Golgi. Indicando que a mutante R85H localiza-se no mesmo compartimento celular que a proteína nativa, sugerindo que o fenótipo da doença não é causado por stress do RE ou por falta de folding da proteína. Ratinhos com deleção genética (KO) na RHBDD2 foram gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 para definir a função da RHBDD2 e o fenótipo dos animais mutantes. Infelizmente, 5 animais fundadores morreram no primeiro dia de vida. Analise do tecido revelou que dois deles tinham INDELs e três deles eram nativos. Logo, a morte dos animais é pouco provável estar relacionada com o genótipo RHBDD2. A experiência foi repetida e 17 potencias fundadores foram obtidos. Resultados de sequênciaçao indicaram que dois animais fundadores tinham a mutação desejada, provavelmente como quimeras. Identificamos também animais fundadores com INDELs de 6 e 9 pares de bases. Experiências de imuno-precepitação acopladas a espectrometria de massa foram realizadas para identificar novos interactores da RHBDD2. Três IPs foram efetuados em diferentes condições (com ou sem crosslinker, acoplado com diferentes tampões de lavagem). Golgins (GM160, Golgin-84, Golgin-45), que atuam como plataformas de acoplamento membranar, foram co-immuno-precepitadas coma RHBDD2 em ambas as experiências com cross-linker, indicando que a RHBDD2 pode ter um papel na manutenção da estrutura do aparelho de Golgi. Componentes chaves das vesículas COPII foram também capturados nos IPs crosslinked e não crosslinked, indicando que a RHBDD2 pode contribuir para o transporte ER para Golgi dependente de COPII. Estes dois grupos apareceram tanto nos IPs da proteína RHBDD2 nativa como mutante R85H. De notar, o número total de identificações de peptídeos está diminuído em IPs de R85H em condições de crosslinking ou na sua ausência, indicando talvez que o mutante R85H, exibe uma alteração conformacional que resulta numa mudança de repertório de interactores. De acordo com as IPs, experiências de fragmentação do Golgi e da sua reorganização, foram efectuadas com RNA de interferência curto (siRNA) para fazer a atenuação da expressão (KD) de RHBDD2 em células HeLa. /2 horas após a transfecçao, as células foram tratadas com BFA, e depois a droga foi removida do meio. De seguida, as células foram fixadas a diferentes pontos de incubação. Esta experiência não resultou em nenhuma diferença óbvia, na cinética de da morfologia do aparelho de Golgi entre as células tratadas control ou com o KD, mas é importante notar que o siRNA não promove a atenuçao complete da expressão da RHBDD2, logo a presença de alguma RHBDD2 residual pode ter prevenido a observação de um fenótipo mais marcado. O papel fisiológico da RHBDD2 permanece desconhecido. Considerando os possíveis parceiros de ligação da RHBDD2 e a localização da RHBDD2, eu proponho que trabalho future se deva focar no teste do tráfego celular e da glicosilação em células sem expressão de RHBDD2 (KO). Também seria útil gerar um mutante R85H endógeno nas células RPE para avaliar a patologia da mutação, e claro, para avaliar o fenótipo dos ratinhos mutantes
Role of RHBDD2 in membrane trafficking regulation
No full textTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015RHBDD2 é parcialmente relacionada com romboides, protéases intra-membranares que degradam substratos na via secretora. Curiosamente, um subgrupo da família romboide, incluindo a RHBDD2, não tem resíduos catalíticos essenciais. Estas “pseudo-proteases” são conservadas, o que implica uma pressão seletiva para manter a sua função durante a evolução. Recentemente, uma mutação pontual (R85H) foi identificada no gene humano que codifica para a proteína RHBDD2, e está associada a uma doença neuro-degenerativa chamada Retinitis Pigmentosa (RP). Esta mutação pontual de G para A, alterou o aminoácido codificado de arginina para histidina no códão 85 do Segundo exão. No entanto a relevância fisiológica da RHBDD2 e a sua contribuição para a doença acima referida não é clara. Os dois maiores focos deste estudo foram (1) a investigação de como a mutação R85H na RHBDD2 contribui para a doença a nível celular; (2) investigar a função da RHBDD2 nativa a nível da célula e do organismo. Vários programas de alinhamento (ClustalO, muscle, tcoffee ferramentas de alinhamento) foram usados para prever a topologia da RHBDD2. Com base na comparação com outros membros da superfamília romboide, os domínios transmembranares (TMD) da RHBDD2 foram previstos. Após identificar cuidadosamente todos os aminoácidos chave nos alinhamentos, eu previ que a RHBDD2 é uma proteína transmembranar com 6 TMD, com ambas as terminações N- e C- presentes na face citoplasmática. Devido ao conhecimento prévio de que a RHBDD2 é expressa em níveis elevados na retina, consistente com a expressão a nível do mRNA na base de dados bioGPS, células de ratinho RPE foram selecionadas como materiais essenciais para as seguintes experiências. Plasmídeos para a sobre-expressão da RHBDD2 WT e da mutação R85H com uma tag de HA no C-terminal foram gerados no vector pLEX MCS, e usados para gerar células estáveis por transdução lentiviral. Estas linhas celulares juntamente com a linha celular com o vector vazio (EV) foram usadas para investigar a função da RHBDD2 a nível bioquímico e da biologia celular. Surpreendentemente, a expressão da forma mutante da RHBDD2 em células RPE, não induziu um stress constitutivo do retículo endoplasmático (RE). Não houce degradação da proteína mutante na linha celular R85H. Isto permitiu-me propor de forma preliminar, que o fenótipo da mutação R85H não é causado por stress do (RE). Por forma a analisar a localização do Et e mutante R85H, células RPE foram marcadas com um anticorpo anti-HA (para detectar RHBDD2 WT e mutante R85H) e com o marcador de stress do RE Calreticulin ou o marcador do cis-Golgi GM130. Imagens de imuno-fluorescência e co-localização mostraram que tanto a WT como a mutante RHBDD2 localizam predominantemente no aparelho de Golgi. Indicando que a mutante R85H localiza-se no mesmo compartimento celular que a proteína nativa, sugerindo que o fenótipo da doença não é causado por stress do RE ou por falta de folding da proteína. Ratinhos com deleção genética (KO) na RHBDD2 foram gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 para definir a função da RHBDD2 e o fenótipo dos animais mutantes. Infelizmente, 5 animais fundadores morreram no primeiro dia de vida. Analise do tecido revelou que dois deles tinham INDELs e três deles eram nativos. Logo, a morte dos animais é pouco provável estar relacionada com o genótipo RHBDD2. A experiência foi repetida e 17 potencias fundadores foram obtidos. Resultados de sequênciaçao indicaram que dois animais fundadores tinham a mutação desejada, provavelmente como quimeras. Identificamos também animais fundadores com INDELs de 6 e 9 pares de bases. Experiências de imuno-precepitação acopladas a espectrometria de massa foram realizadas para identificar novos interactores da RHBDD2. Três IPs foram efetuados em diferentes condições (com ou sem crosslinker, acoplado com diferentes tampões de lavagem). Golgins (GM160, Golgin-84, Golgin-45), que atuam como plataformas de acoplamento membranar, foram co-immuno-precepitadas coma RHBDD2 em ambas as experiências com cross-linker, indicando que a RHBDD2 pode ter um papel na manutenção da estrutura do aparelho de Golgi. Componentes chaves das vesículas COPII foram também capturados nos IPs crosslinked e não crosslinked, indicando que a RHBDD2 pode contribuir para o transporte ER para Golgi dependente de COPII. Estes dois grupos apareceram tanto nos IPs da proteína RHBDD2 nativa como mutante R85H. De notar, o número total de identificações de peptídeos está diminuído em IPs de R85H em condições de crosslinking ou na sua ausência, indicando talvez que o mutante R85H, exibe uma alteração conformacional que resulta numa mudança de repertório de interactores. De acordo com as IPs, experiências de fragmentação do Golgi e da sua reorganização, foram efectuadas com RNA de interferência curto (siRNA) para fazer a atenuação da expressão (KD) de RHBDD2 em células HeLa. /2 horas após a transfecçao, as células foram tratadas com BFA, e depois a droga foi removida do meio. De seguida, as células foram fixadas a diferentes pontos de incubação. Esta experiência não resultou em nenhuma diferença óbvia, na cinética de da morfologia do aparelho de Golgi entre as células tratadas control ou com o KD, mas é importante notar que o siRNA não promove a atenuçao complete da expressão da RHBDD2, logo a presença de alguma RHBDD2 residual pode ter prevenido a observação de um fenótipo mais marcado. O papel fisiológico da RHBDD2 permanece desconhecido. Considerando os possíveis parceiros de ligação da RHBDD2 e a localização da RHBDD2, eu proponho que trabalho future se deva focar no teste do tráfego celular e da glicosilação em células sem expressão de RHBDD2 (KO). Também seria útil gerar um mutante R85H endógeno nas células RPE para avaliar a patologia da mutação, e claro, para avaliar o fenótipo dos ratinhos mutantes
Role of the ER membrane protein complex (EMC) as a regulator of lipid homeostasis
No full text"The proper synthesis of transmembrane proteins is crucial for
performing essential functions in a wide range of biological
activities, such as maintaining cellular homeostasis, production of
lipid droplets, and many other processes that directly influence the
organism’s physiology.
The synthesis and folding of these proteins, which occurs mainly in
the Endoplasmic Reticulum (ER), requires highly conserved protein
mechanisms for inserting hydrophobic transmembrane domains
into the bilipid layer. As well as facilitating the integration of integral
proteins into the lipid bilayer, these protein “insertase” machineries
also help prevent the accumulation of misfolded proteins, avoiding
ER stress.(...)
Molecular Pathways and Mechanisms in the Biogenesis of Influenza A Virus Matrix Protein 2
No full text"Membrane protein biogenesis is an essential cellular process, ensuring the proper
synthesis, targeting, and insertion of proteins into biological membranes. This thesis
investigates the molecular mechanisms governing membrane protein biogenesis,
with a particular focus on how the Influenza A Virus (IAV) hijacks host cellular
pathways to support viral protein production. The study primarily explores the role of
the Endoplasmic Reticulum Membrane Protein Complex (EMC) in the biogenesis of
the IAV M2 protein, an integral membrane protein that functions as a proton channel
critical for viral replication, budding, and host cell remodeling.(...)
Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences
Full text linkThe cytotoxic lymphocyte protease granzyme B (GzmB) can promote apoptosis through direct processing and activation of members of the caspase family. GzmB can also cleave the BH3-only protein, BID, to promote caspase-independent mitochondrial permeabilization. Although human and mouse forms of GzmB exhibit extensive homology, these proteases diverge at residues predicted to influence substrate binding. We show that human and mouse GzmB exhibit radical differences in their ability to cleave BID, as well as several other key substrates, such as ICAD and caspase-8. Moreover, pharmacological inhibition of caspases clonogenically rescued human and mouse target cells from apoptosis initiated by mouse GzmB, but failed to do so in response to human GzmB. These data demonstrate that human and murine GzmB are distinct enzymes with different substrate preferences. Our observations also illustrate how subtle differences in enzyme structure can radically affect substrate selection
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