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I segnali trasdotti dal recettore del PDGF:implicazioni per la sclerosi sistemica.
No full textLo scopo di questa ricerca e' la comprensione dei meccanismi di trasduzione dei segnali da parte dei recettori del PDGF (alfa e beta). Particolare enfasi ed attenzione sara' dedicata alla struttura del complesso del recettore in membrana. L'analisi sara' estesa ai meccanismi ed ai bersagli riconosciuti dal PDGF e dagli anticorpi contro il recettore trovati nei pazienti sclerodermici. Un importante bersaglio gia individuato nel precedente progetto e’ l’enzima NADPH ossidasi.
Gli obiettivi specifici sono : 1. identificare i segnali ed i "targets" attraverso i quali il PDGF e gli anticorpi, isolati da pazienti sclerodermici, riconoscono il PDGFR ed attivano l'enzima NADPH ossidasi; 2. identificare i segmenti dei recettore PDGFR alfa e beta riconosciuti dagli anticorpi isolati dal siero di pazienti sclerodermici; 3. implementare e validare il saggio per svelare la presenza di anticorpi anti-PDGFR nei sieri dei pazienti sclerodermici.
Questi obiettivi saranno raggiunti in 2 fasi : nella I fase analizzeremo la formazione del complesso recettore–PDGF/anticorpi isolati dai pazienti , utilizzando diverse proteine ricombinanti corrispondenti ai recettori alfa e beta. In questi complessi valuteremo la presenza sia di H Ras che della subunita’ della NADPH ossidasi, gp91. Mediante selettivi silenziamenti (Ras, subunita del recettore alfa e beta, gp91) valuteremo se la presenza di questi componenti (Ras e/o gp91) nel complesso con il recettore e' essenziale per la produzione dei ROS indotti sia dal PDGF che dalle immunoglobuline.
Nella seconda fase utilizzeremo queste informazioni per selezionare dei costrutti ricombinanti del PDGFR fusi a specifici "tags”. Ci aspettiamo che queste proteine riconoscono sia gli anticorpi che gp91. Le proteine ricombinanti positive saranno prodotte in grande quantita', fissate su una superficie rigida ed usate come "esche" per svelare gli anticorpi nel siero di pazienti sclerodermici.
Ci aspettiamo di individuare:1. nuovi componenti fisicamente legati al PDGFR che mediano i segnali del PDGF; 2. di verificare e validare in modo definitivo gli anticorpi presenti nei pazienti sclerodermici identificando il segmento del recettore riconosciuto dagli stessi ; e 3. in ultimo, sonde specifiche per questi anticorpi per determinare il loro grado di specificita'
Patologia molecolare della sclerosi sistemica: un kit per la diagnosi precoce e definitiva della malattia.
No full textGeni di vulnerabilità e di riparazione del DNA quali bersagli farmacologici per la terapia di malattie neurodegenerative.
No full textGENI COINVOLTI NELLA TRASMISSIONE DEI SEGNALI CAMP E RAS. MANIPOLAZIONE DELLA LORO ESPRESSIONE ED ATTIVIT`. TERAPIA GENICA SOMATICA
No full text1. Isolamento di proteine AKAP specifiche di tessuto (tiroide, cuore, endotelio e colon) che legano PKA sul mitocondrio, Golgi e citoscheletro. Saranno costruiti mutanti dominanti negativi e positivi che inibiscono od attivano il circuito di segnalazione cAMP locale (mitocondrio, membrana citoplasmatica) e nucleare.
2. Sarà determinato il meccanismo molecolare della azione dei geni Ras sul potenziale redox. Specificamente, vogliamo
determinare la localizzaione di Ki Ras e come quest'ultimo attiva la superossido dismutasi mitocondriale (CuSOD).
Vogliamo inoltre sviluppare sistemi di inibizione specifica di H e K in vivo.
3. Sarà determinato il meccanismo molecolare della attivazione di Ras e Src da parte degli androgeni ed estrogeni. I vettori e reagenti sviluppati in (2) saranno utilizzati anche in sistemi estrogeno androgeno-dipendenti allo scopo di inibire solo l'effetto mitogenico indotto da estrogeni ed androgeni, lasciando intatto l''effetto differenziativo.
4. Sarà analizzato il meccanismo molecolare della attivazione da parte di cAMP-PKA di promotori contenti CAAT . Mutagenesi dei fattori NFYA, B e C per determinare i requisiti e la regolazione del complesso NFY/p300; B. Saranno isolati i geni che interagiscono con CREM (CREB modulator) e geni attivati da cAMP in fegato rigenerante.
5. Saranno sviluppati modelli in vivo per testare l'efficacia biologica dei reagenti sviluppati nei punti (1), (2) e (3). I sistemi che svilupperemo saranno: angioplastica carotidea; cuore perfuso; eccitosssicità nel SNC da iniezione locale di glutammato
Bersagli molecolari in complessi multiproteici che trasmettono segnali metabolici, proliferativi ed infiammatori.
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Role of Leptin and metabolism in survival of autoreactive CD4+ T cells.
No full textRecent evidence has shown that leptin, the adipose-tissue derived hormone, can influence T cell homeostasis and survival through the control of genes involved in these processes. Leptin deficient ob/ob mice and humans show reduced circulating number of T cells particularly in the CD4+ compartment. Here, we investigate in vivo how leptin controls survival and proliferation of normal and autoreactive CD4+ T cells. We have previously observed the impaired capacity of myelin-olygodendrocyte glycoprotein peptide (MOG35-55)-specific CD4+ T cells, to transfer experimental autoimmune encephalomyeleitis (EAE) in ob/ob mice. In vivo this process was associated with a progressive decline in dalyed-type hypersensitivity responses (DTH) and proliferation against the MOG35-55 peptide. Adoptive transfer experiments with pathogenic-MOG35-55-activated CD4+ T cells labeled with the fluorescent die 5-6-carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) into normal wild-type (WT), ob/ob and ob/ob-recombinant leptin (rleptin) treated mice, showed in ob/ob mice a reduction of the number of CFSE+CD4+ T cells at different time points as well as increased apoptosis rate and reduced Bcl-2 expression. Similar results were obtained after transferring into ob/ob mice homogeneous, antigen-specific T cells from pigeon cytochrome c (PCC) transgenic (AND-TCR) mice. Next, we explored the molecular targets possibly involved in this process and concentrated our attention on the AKT-mammalian-target of rapamycin (mTOR) signaling pathway. We observed a reduced expression of the AKT and of the downstream mTOR target, S6 ribonuclear protein (S6), in MOG35-55-specific T cells transferred into ob/ob mice. The involvement of the mTOR pathway was also confirmed by a reduced survival of the CD4+ T cells in WT mice after treatment with rapamycin and subsequent reduction in circulating leptin levels. These data highlight the role of leptin in the regulation of survival and proliferation of autoreactive T cells and link the metabolism to autoimmunity
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