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Formyl-peptide receptors, NADPH oxidase and replicative senescence
No full textThe formyl-peptide receptor family members FPR, FPRL1 and FPRL2, expressed in human cells, belong to pertussis toxin sensitive G-protein coupled seven transmembrane receptor family (GPCR). In polymorphonucleate cells (PMN) binding of small formyl-peptide derivatives, whose prototype is N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (N-fMLP), to these receptors triggers a complex program that results in cell migration, reorganization of the actin cytoskeleton and superoxide anion generation through NADPH oxidase activation. FPR and FPRL1 bind N-fMLP with high and low efficiency, respectively. FPRL2 does not respond to formyl-peptides and it was described as a low affinity receptor for several FPRL1 agonists.
FPR and FPRL1 were initially detected in phagocytic leukocytes, while FPRL2 was described only in monocytes and in dendritic cells but in the last years many results demonstrate that several other cell types and tissues also express these receptors.
In addition to N-fMLP, several nonformylated peptide agonists or other non-proteic ligands that preferentially activate either or both FPR and FPRL1 in nonphagocytic cells have been identified. They include WKYMVm peptide, isolated by screening a random oligonucleotide library, annexin 1, lipoxin A4 (LXA4), urokinase and its receptor, serum amyloid A, humanin and cathelicidin LL-37.
Phagocytic NADPH oxidase activation and the subsequent reactive oxygen specie (ROS) generation represents one of the downstream target of the signaling cascade triggered by FPR and/or FPRL1. Proteins homologous to the membrane catalytic subunit gp91phox and to the cytosolic regulatory components p47phox and p67phox of NADPH oxidase also have been identified in nonphagocytic cells. Compared with PMN, much less is understood about the signal transduction pathways involved in the regulation of the activation of nonphagocytic NADPH oxidase, triggered by formyl-peptide receptors/agonist interaction.
We demonstrated that human fibroblasts and epithelial cells express FPRL1 and an enzymatic machinery homologous to phagocytic NADPH oxidase. In serum-deprived cells, exposure to growth factors stimulates NADPH oxidase to generate superoxide anion and treatment with NADPH oxidase inhibitors results in impairment of the serum-induced signaling cascade. Furthermore, exposure to N-fMLP or to 10-fold lower concentration of WKYMVm for short times (1’) induces superoxide generation due to serine-phosphorylation and membrane translocation of the regulatory citosolic NADPH oxidase subunit p47phox. These effects are in large part mediated by the rapid activation of ERKs and are inhibited by pertussis toxin, suggesting the involvement of CPCRs. In addition to ERKs, in these cells exposed to N-fMLP or WKYMVm, p47phox phosphorylation and its translocation on membrane also requires Protein kinase C-α and -δ.
On the other hand the exposure for longer times (up to 3hrs) induces p21waf1 accumulation, the block of the G1/S cycle, a significative increase of β-gal positive cells and the appearance of a senescent phenotype
Identificazione dei meccanismi di attivazione di una NADPH ossidasi non fagocitica da parte dei formil peptidi
No full textScopo del presente progetto é stata la dettagliata caratterizzazione dei pathway molecolari implicati nell’attivazione della NADPH ossidasi espressa in fibroblasti umani dopo stimolazione con peptidi formilati (N-fMLP) e non, nonché l’analisi di geni differenzialmente espressi in seguito a tale trattamento.
L’approccio sperimentale utilizzato in questi studi é consistito nella stimolazione di fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, che esprimono una macchina molecolare simile alla NADPH ossidasi, con concentrazioni e tempi diversi di N-fMLP che rappresenta un forte attivatore della NADPH ossidasi fagocitica. E’ stata valutata la capacità dei formil-peptidi di attivare l’ossidasi mediante saggi di attività enzimatica ed analisi, mediante western blot, della subunità regolatoria citosolica p47phox della NADPH ossidasi, I risultati ottenuti dimostano che in seguito a tale trattamento si osserva i) una rapida attivazione della NADPH ossidasi, inibibile dalla superossido dismutasi; ii) la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox, che rappresenta l' evento necessario richiesto per l’attivazione di questa macchina molecolare. Inoltre, la pre-incubazione con PD098059, un inibitore di MEK1, prima della stimolazione previene completamente i fenomeni osservati suggerendo il coinvolgimento delle ERK in questi eventi. Abbiamo infatti successivamente dimostrato che in fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, concentrazioni micromolari di N-fMLP inducono una rapida fosforilazione/attivazione di ERK1/2, misurata in esperimenti di western blot condotti con un anticorpo anti-fosfoERK e che questa è completamente prevenuta da PD098059.
In cellule fagocitiche N-fMLP interagisce con almeno due tipi di recettore, uno ad alta affinità (FPR) e l’altro a bassa affinità (FPRL1), ed attiva una cascata di segnali, mediati da proteine G eterotrimeriche sensibili alla tossina della pertosse (PTX), che conduce alla migrazione cellulare, alla fagocitosi, al rilascio di mediatori pro-infiammatori ed alla generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) via attivazione della NADPH ossidasi.
Fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero sono stati quindi preincubati con PTX prima della stimolazione con N-fMLP ed esperimenti condotti su estratti proteici purificati da queste cellule hanno dimostrato che PTX è in grado i) di inibire la fosforilazione delle ERK da parte del formil-peptide; ii) di prevenire l’attivazione NADPH-dipendente della NADPH ossidasi non fagocitica; iii) di inibire la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana della subunità catalitica p47phox. Questi esperimenti suggeriscono che N-fMLP é capace di attivare la NADPH ossidasi via proteine G sensibili a PTX e che le cellule IMR90 esprimono recettori specifici per formil-peptidi.
E’ stata quindi analizzata l’espressione in queste cellule del recettore FPR e FPRL1 mediante esperimenti di RT-PCR condotti su RNA totale purificato da cellule IMR90 ed utilizzando primer specifici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che queste cellule esprimono soltanto il recettore a bassa affinità FPRL1 il quale é noto mostrare una più alta affinità per l’esapeptide WKYMVm (peptide W) rispetto a N-fMLP. Esperimenti condotti utilizzando il peptide W hanno infatti dimostrato la sua capacità di indurre una significativa attivazione delle ERK e la traslocazione sulla membrana di p47phox a concentrazioni più basse rispetto a quelle utilizzate per N-fMLP.
Mediante saggi di legame al recettore, condotti con WKYMVm iodinato, é stato anche analizzato il legame specifico del peptide W su FPRL1. I risultati hannno dimostrato che sulla membrana dei fibroblasti umani sono espressi siti di legame per il peptide W i quali sono specificamente spiazzati da concentrazioni crescenti di peptide non marcato. Inoltre, l’analisi dei dati di binding hanno consentito di predirre una costante di dissociazione di 160 nM ed una densità di circa 16200 molecole di recettore/cellula.
Tale recettore é biologicamente funzionale. Infatti, FPRL1, opportunamente clonato in un vettore di espressione eucariotica, é stato trasfettato in cellule HEK293 prima della stimolazione con N-fMLP (o con WKYMVm). Tali cellule esprimono NOX4, un membro della famiglia delle NADPH ossidasi non fagocitiche, ma non recettori per i formil-peptidi. La determinazione della produzione di anione superossido NADPH-dipendente, misurata come velocità di riduzione del citocromo c sensibile alla superossido dismutasi, ha dimostrato che in HEK293 trasfettate con FPRL1 è possibile misurare un significativo aumento di ROS, mentre nessun effetto è rivelabile nelle cellule trasfettate con il plasmide di controllo.
Nelle cellule polimorfonucleate l’interazione tra i formil-peptidi ed i rispettivi recettori serpentinici accoppiati a proteine G eterotrimeriche attiva la fosfolipasi Cbeta che genera inositolo 1,4,5-trifosfato e diacil-glicerolo. La proteina kinasi C (PKC) così attivata é responsabile della fosforilazione di residui di serina (diversi da quelli che sono bersaglio delle ERK) della subunità regolatoria p47phox della NADPH ossidasi.
E’ stato quindi valutato il ruolo delle PKC sull’attivazione della ossidasi non fagocitica in cellule IMR90, utilizzando inibitori specifici delle varie isoforme della famiglia di PKC (Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina). Go6976 inibisce preferenzialmente PKC alfa, beta e mu, Go6983 inibisce PKC alfa, beta, gamma, delta e teta, GF109203X inibisce PKC alfa, beta, delta, epsilon, teta e mu e la rottlerina é un inibitore abbastanza specifico per la PKC delta.
Saggi di attivazione hanno dimostrato che in queste cellule la stimolazione con il peptide W fosforila un peptide substrato della PKC in maniera dose dipendente. Poiché PKC attivata stimola ERK, Ras e Raf in molti tipi cellulari é stato innanzitutto valutato il ruolo di questa kinasi sull’attivazione delle ERK in cellule IMR90 incubate con il peptide. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il pretrattamento con Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina attenuano significamente la fosforilazione delle ERK in maniera dose-dipendente.
Successivamente é stata analizzata la capacità di questi inibitori di prevenire l’attivazione della NADPH ossidasi. I risultati dimostrano che la rottlerina, Go6976 e GF109203X inibiscono la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox. In accordo, saggi di attività enzimatica condotti su frazioni di membrana e citosoliche in presenza di NADPH, FAD e ferricitocromo c, hanno dimostrato che tali inibitori prevengono anche la riduzione del citocromo c ad opera dell’anione superossido generato dalla NADPH ossidasi attivata dal peptide W.
Sulla base dei risultati ottenuti é stata condotta una analisi mediante western blot per identificare le isoforme di PKC attivate dal peptide W e coinvolte nel processo di attivazione della ossidasi non fagocitica. I risultati ottenuti dimostrano che PKC delta, e non altre isoforme, si attiva traslocando sulla membrana dopo 2’ di incubazione con il peptide W e la sua attivazione é richiesta per il completo funzionamento della NADPH ossidasi. Infatti, saggi di produzione di ROS hanno dimostrato che la loro generazione da parte della ossidasi non fagocitica é prevenuta dall’incubazione con gli inibitori di PKC, in particolare dalla rottlerina
Regolazione della NADPH ossidasi non fagocitica mediata dal recettore FPRL1: effetto delle specie reattive dell'ossigeno generate sulla regolazione dell'espressione genica
No full textL'obiettivo di questo studio è stato: i) l' identificazione, in fibroblasti umani IMR90, delle kinasi responsabili della fosforilazione di p47phox e quindi del fine controllo della NADPH ossidasi non fagocitica; ii) l'analisi dell'espressione genica in seguito a modificazioni delle condizioni redox intracellulari indotte dal peptide WKYMVm. Abbiamo innanzitutto analizzato la capacità del peptide W di attivare PKC in cellule IMR90. L'attività di PKC negli estratti totali è stata misurata a 1 e 5 minuti dopo stimolazione dei fibroblasti umani deprivati di siero con 10 micromolare WKYMVm. I risultati hanno dimostrato che l'attività enzimatica, misurata come la capacità di fosforilare un peptide bersaglio contenente siti di fosforilazione di PKC, è rilevabile dopo 1 minuto ed aumenta significativamente dopo 5 minuti di esposizione a WKYMVm. E' stato dimostrato che le PKC attivate stimolano Ras, Raf e le ERK in diversi tipi cellulari e che l'attivazione delle ERK mediante TPA è prevenuta dagli inibitori di PKC. Inoltre, la fosforilazione delle ERK indotta da N-fMLP in neutrofili è inibita da GF109203X e dalla calphostina c. Abbiamo quindi analizzato se isoforme di PKC sensibili a GF109203X e a Go6983 sono coinvolte nella fosforilazione delle ERK in cellule IMR90 stimolate con WKYMVm. I risultati hanno mostrato che la preincubazione con GF109203X, che agisce come inibitore competitivo per il sito di legame all'ATP di PKC, o con Go6983 previene l'attivazione di ERK2 in maniera dose-dipendente. Poichè le PKC convenzionali sono attivate dal calcio e dal DAG mentre le PKC nuove sono calcio-insensibili, abbiamo anche analizzato gli effetti della deplezione del calcio intracellulare sulla attivazione delle ERK. I dati ottenuti hanno rivelato che la preincubazione con il chelante del calcio BAPTA-AM previene significativamente la fosforilazione delle ERKin maniera dose-dipendente. Questi risultati suggeriscono che isoforme di PKC calcio-dipendenti agiscono sulla regolazione della fosforilazione delle ERK, ma non possono escludere che anche isoenzimi di PKC calcio-indipendenti sono coinvolti. Abbiamo inoltre dimostrato che in cellule IMR90 stimolate con il peptide W, la preincubazione con GF109203X o con Go6983 previene la fosforilazione di p47phox e la sua traslocazione sulla membrana. Abbiamo anche analizzato il ruolo dei due inibitori di PKC nella attivazione della NADPH ossidasi mediata da WKYMVm. Membrane purificate da fibroblasti stimolati con il peptide W o preincubati con GF109203X o Go6983 prima della stimolazione, sono stati incubati con le corrispettive proteine citosoliche e cimentate in un saggio di riduzione del citocromo c sensibile alla SOD. I risultati hanno dimostrato che la generazione di superossido NADPH-dipendente è prevenuta dopo trattamento con GF109203X o Go6983. Sono stati successivamente analizzati gli isoenzimi di PKC attivati in seguito all'esposizione a WKYMVm investigando sulla loro compartimentalizzazione cellulare dopo la stimolazione. In risposta al peptide W, delle sette isoforme di PKC che abbiamo analizzato solo PKC-alfa e PKC-delta traslocano dalla frazione citosolica a quella di membrana ed un significativo aumento nelle quantità di queste isoforme nella frazione di membrana è osservabile dopo 1 minuto di trattamento. Poichè PKC-alfa e PKC-delta sono attivate in fibroblasti umani IMR90 stimolati con WKYMVm, si è proceduto ad analizzare gli effetti di Go6976, un inibitore selettivo degli isoenzimi calcio-dipendenti PKC-alfa e PKC-betaI, e della rottlerina, un inibitore selettivo dell'attività enzimatica di PKC-delta, sulla attivazione delle ERK e sulla fosforilazione e traslocazione di p47phox. Esperimenti di western blot ci hanno consentito di dimostrare che la preincubazione con Go6976 o con rottlerina causa una inibizione dose-dipendente della attivazione delle ERK nonchè previene l'assemblaggio della NADPH ossidasi, inibendo la fosforilazione e la traslocazione di p47phox
Cascate di segnalazione innescate dai recttori per formil-peptidi in cellule non fagocitiche
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Attivazione dei recettori per formil-peptidi e regolazione della NADPH ossidasi in lineee cellulari tumorali umane non fagocitiche
No full textL’obiettivo del presente progetto è quello di identificare, in linee cellulari tumorali stimolate con ligandi per i recettori dei formil-peptidi, i pathway di segnale coinvolti nella fosforilazione di p47phox e quindi del controllo della NADPH ossidasi non fagocitica, nonchè la cascata di segnalazione capace di promuovere la proliferazione cellulare.
In particolare ci proponiamo di: i) identificare il recettore per formil-peptidi e le componenti della ossidasi espressi nelle cellule HCT-116 (carcinoma umano del colon), HepG2 (epatoma umano), Saos-2 (osteosarcoma umano) e Calu-6 (carcinoma anaplastico umano del polmone), ii) valutare il ruolo dell’espressione e dell’attivazione di Nox, dopo stimolazione con gli opportuni ligandi, nella patogenesi dei tumori; iii) studiare il pathway di segnalazione intracellulare innescato dal legame agonista/recettore (FPR e/o FPRL1) che conduce all’attivazione di Nox e responsabile della proliferazione cellulare
Transactivation of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) by Formyl Peptide Receptor (FPRL1) in CaLu-6 cells
No full textTransactivation of receptor tyrosine kinases mediated by FPRL1
No full textFormyl-peptide receptors stimulation by specific agonists trigger transactivation of tyrosine kinase receptors EGFR, c-Met and VEGF
A mouse tRNA pseudogene derived from a tRNATrp coding sequence
No full textThe identification and characterization of a mouse tRNA(Trp) pseudogene is reported. A synthetic oligonucleotide (31 mer), identical with the 3' half of a tRNA(Trp), was used to examine three mouse lambda clones that are known to contain clusters of tRNA genes. A fragment of one of these lambda clones strongly hybridizes to the oligonucleotide; the sequence of this region shows the presence of a gene significantly homologous to the chick tRNA(Trp). However two point mutations and a three base deletion prevent the folding of a possible transcript of this gene. The presence of a conserved promoter sequence for RNA polymerase III, that should allow the transcription of this gene, does not ensure the transcription of the gene, at least in our in vitro system
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