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Identificazione di proteine con attività di legame agli mRNA degli antigeni MHC di classe II
No full textIn questa tesi di dottorato viene dimostrato che due proteine, Ebp1 e DRBP76/NF90 legano le regioni 3’UTR degli mRNA per gli antigeni MHC di classe II (HLA-DRA, HLA-DRB1 e HLA-DQA1). Esperimenti di silenziamento delle due proteine hanno permesso di studiare il loro ruolo funzionale nella regolazione dei messaggeri per MHC-II . Gli esperimenti hanno fornito le seguenti evidenze.
1) Il silenziamento degli mRNA codificanti le proteine EBP1 e NF90 determina una diminuzione degli mRNA totali per gli MHC-II. Tale diminuzione può essere spiegata da una funzione a livello trascrizionale da parte di entrambe le proteine. Molti lavori pubblicati indicano che la funzione del transattivatore dei geni per gli MHC-II, CIITA, è inibita dalle HDAC (Histone deacetylase) e questa azione richiede un corepressore delle HDAC, sin3A. Inoltre è stato trovato che EBP1 inibisce la trascrizione dei geni del recettore degli androgeni interagendo con HDAC e sin3A. Si può ipotizzare che EBP1 interagisca e sequestri le HDAC, le quali, distaccandosi dal promotore, consentirebbero l’interazione del transattivatore CIITA e la trascrizione dei geni per MHC-II. Invece quando viene silenziata EBP1, diminuisce il suo legame con le HDAC, le quali possono legare il promotore inibendo la trascrizione. Diversamente è già stato dimostrato che NF90 legherebbe il primo introne del gene HLA-DRA modulando negativamente l’espressione di HLA-DRA.
2) La riduzione delle proteine EBP1 ed NF90 genera un incremento della stabilità dei trascritti per MHC-II. Tale risultato indica che le proteine agirebbero anche a livello post-trascrizionale destabilizzando i messaggeri per MHC-II.
3) La diminuzione di entrambe le isoforme NF90 e NF110 non causa variazione della quantità totale dei messaggeri né della loro emivita. Quindi i risultati indicano un ruolo differente delle isoforme NF90 e NF110. NF90 agirebbe in eventi di regolazione trascrizionali e post-trascrizionali, mentre ad NF110 si può attribuire una funzione nella modulazione dei trascritti per MHC-II a livello post-trascrizionale, forse nella regolazione del trasporto da nucleo a citoplasma.
4) I risultati ottenuti da esperimenti di trasfezione e silenziamento dei messaggeri codificanti le catena alfa e beta dell’eterodimero HLA-DR mostrano che l’iper-espressione di uno dei due messaggeri genera un aumento anche dell’altro, mentre la riduzione di uno dei due messaggeri causa diminuzione dell’altro. Sembra quindi che tali trascritti siano fisicamente associati e coregolati durante il processing nel citoplasma grazie al legame con le stesse proteine. L’accoppiamento di eventi di regolazione trascrizionali e post-trascrizionali potrebbe garantire un’espressione coordinata delle molecole MHC-II, permettendo all’occorrenza di rispondere rapidamente ad uno stimolo esterno, ma anche di bloccarne l’espressione degradando le molecole di mRNA velocemente attraverso una modulazione della stabilità (come avviene per i messaggeri istonici ).
5) Infine, i risultati permettono di ipotizzare che Ebp1 ed le NFAR (NF90 e NF110) potrebbero far parte di uno stesso complesso RNP, in grado di regolare l’espressione dei messaggeri codificanti le due catene. Tali proteine, già note per legare regioni di double strand RNA, potrebbero interagire con una struttura secondaria e/o fattori con attività in cis condivisi dalla 3’UTR degli mRNA MHC-II. Questa ipotesi suggerirebbe che gli mRNA degli antigeni MHC- II, codificanti molecole diverse ma con la stessa funzione di presentazione dell’antigene, potrebbero far parte di un medesimo “operone a RNA”
Nuove molecole per una originale terapia delle malattie cardiovascolari causate da ridotta efficienza del trasporto inverso del colesterolo
No full textE' stato verificato che i livelli di aptoglobina (Hpt), se elevati come nella fase acuta dell'infiammazione, inibiscono l'esterificazione del colesterolo da parte dell'enzima LCAT. In particolare, tale inibizione risulta dal legame di Hpt con l'apolipoproteina A-I (ApoA-I). Sono stati progettati peptidi mimetici di ApoA-I, in base alla sequenza polipeptidica legata da Hpt, che sono risultati capaci di spiazzare Hpt da ApoA-I e dalle HDL, di cui ApoA-I è apolipoproteina maggioritaria. Analogamente, è stata analizzata una collezione di semplici molecole organiche per selezionare quelle capaci di questa attività. I peptidi e le molecole selezionate sono state in grado di rispristinare, in saggi dell'attività di LCAT, l'esterificazione stimolata da ApoA-I, mentre non hanno alterato la capacità di Hpt a sequestrare emoglobina libera
RILEVANZA DELL'APTOGLOBINA E DELLO STATO REDOX PLASMATICO NELLA RIMOZIONE DEL COLESTEROLO CELLULARE.
No full textE' stato dimostrato l'effetto inibitorio dell'aptoglobina sulla rimozione del colesterolo dalle cellule della granulosa umane. Tale rimozione è necessaria, nella fase preovulatoria, per prevenire l'accumulo di progesterone, che inibisce la sintesi di estradiolo. L'inibizione è dovuta al legame dell'aptoglobina all'apolipoproteina A-I, che stimola l'enzima LCAT (a esterificare il colesterolo cellulare in eccesso, per il prelievo e l'allontanamento in circolo con le HDL). E' stata studiata la rilevanza del fenotipo dell'aptoglobina sul controllo dell'attività enzimatica. E' stato appurato che le isoforme di aptoglobina sono soggette a variabilità quantitativa durante l'esercizio fisico. E' stata definita la correlazione negativa tra il rapporto del colesterolo esterificato col colesterolo non esterififcato nelle HDL (CE/C) e lo spessore delle tuniche media ed intima della parete vascolare
Il trasporto inverso del colesterolo in conigli alimentati con dieta aterogenica ed in topi infiammati con carragenina
No full textStudi di grande importanza hanno confermato che LCAT rappresenta un enzima dalle spiccate proprietà antiaterogeniche. Infatti, conigli transgenici, in cui è stata indotta una superespressione di LCAT e che sono stati sottoposti ad una dieta ricca di colesterolo, hanno mostrato, rispetto ai controlli, un aumento significativo nelle concentrazioni plasmatiche di ApoA1 e di colesterolo-HDL: questo profilo lipoproteico è associato ad una diminuzione significativa delle lipoproteine cosiddette “aterogeniche” (VLDL e LDL) (Hoeg et al., JBC 1996). Inoltre, la superespressione di LCAT ha portato, in tali conigli, ad una riduzione dell’aterosclerosi, poiché l’analisi dell’aorta ha rivelato che essi avevano una riduzione dell’86% della dimensione della lesione aterosclerotica rispetto ai controlli. Questi risultati indicano che la regolazione dell’attività LCAT gioca un ruolo chiave nell’omeostasi cardiovascolare, in termini di prevenzione dell’aterosclerosi, e rappresenta un nuovo bersaglio per lo sviluppo di strategie terapeutiche, farmacologiche e geniche (Hoeg et al., PNAS 1996). Il contributo, a tale tematica, di questo progetto di ricerca riguarda proprio alcuni meccanismi di regolazione di LCAT. Oggi gli scienziati concordano sul fatto che l’infiammazione possa essere causa di sviluppo e progressione dell’aterosclerosi (Libby et al., 2002). Nei conigli, alimentati con una dieta arricchita in colesterolo, si osserva una deplezione di LCAT compatibile con alterazioni da stress ossidativo (che aumenta notevolmente durante l’infiammazione) o con una diminuzione della sua sintesi epatica, dal momento che malattie del fegato, associate a steatosi e fibrosi, sono state individuate nel coniglio sottoposto a dieta aterogenica (Kainuma et al., 2006; Wanless et al., 1996; Buyssens et al., 1996; Gupta et al., 1976). La diminuzione di LCAT, associata alla diminuzione del suo principale effettore positivo (Apo A-I), comporta un’alterazione del RCT, che è una delle cause alla base della formazione delle placche aterosclerotiche. Nonostante la diminuzione rilevata per la quantità di enzima presente in circolo nei conigli ipercolesterolemici, tale quantità è sufficientemente stimolata dalla disponibilità di substrato, secondo la cinetica di Michaelis-Menten. Quindi, nel caso dei conigli, si assiste ad una deplezione di LCAT, ma contemporaneamente la quota restante è maggiormente attiva, rispetto a condizioni normali. Nei topi, al contrario, si assiste, durante l’infiammazione, ad un’alterazione dell’attività dell’enzima, mentre non si rilevano variazioni nell’attività in vitro. In questo caso, dopo aver constatato la correlazione tra l’inibizione enzimatica ed il rapporto molare tra Hpt ed Apo A-I, è importante dimostrare che è possibile ripristinare la normale attività enzimatica mediante l’utilizzo di un peptide mimetico di Apo A-I, capace di spiazzare Hpt da Apo A-I in vitro. Ciò dimostrerà come la regolazione dell’attività LCAT, in vivo, possa rappresentare un bersaglio per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e farmacologiche
ANALISI DELLO STATO REDOX NEL FOLLICOLO OVARICO UMANO E BUFALINO.
No full textSono stati titolati i principali antiossidanti fisiologici nel fluido follicolare ovarico umano e bufalino. Sono state rilevate importanti correlazioni con lo stato di maturazione ovocitaria. Nel bufalo, è stato appurato che condizioni di mancato afflusso ematico stimolano la sintesi di ascorbato da parte delle cellule della granulosa. In questa stessa specie, è stato studiato come l'alterazione del livello antiossidante sia correlato con l'attivazione del programma di apoptosi nelle cellule della granulosa. Nell'uomo, è stato definito che il livello di antiossidanti è correlato col rapporto tra estradiolo e progesterone (nelle fase precoce preovulatoria) e con l'attività dell'enzima LCAT (che previene l'accumulo di colesterolo e la eccessiva ed inibitoria sintesi di progesterone nelle cellule della granulosa). Bassi livelli di antiossidanti, nel fluido follicolare ovarico umano, sono associati ad ovociti con bassa capacità di fecondazione
Stato ossido-riduttivo e risposta fisiologica a modificazioni ambientali in Bubalus bubalis
No full textE' stato studiato l'effetto della temperatura ambientale sui livelli di ormoni tiroidei, sul loro trasporto con retinolo e tocoferolo in circolo, sui livelli di ascorbato e vitamine liposolubili. E' stato studiato l'effetto della densità di stabulazione sullo stato redox plasmatico, sulla produzione di latte e sulla performance riproduttiva. Infine è stata valutata l'ossidazione proteica e lipidica nel latte e nel suo prodotto di trasformazione più commerciale (mozzarella)
A zinc-protein from rat prostate fluid binds epididymal spermatozoa
No full textThe detection and the isolation of a zinc-protein from the secretion of the rat dorsolateral prostate is described. The purification procedure, based on gel filtration and cationic exchange chromatography, allowed to separate a minor protein (Mr 66,000) from free zinc ions and other secretory components. Two zinc ions were estimated to be associated with one molecule of isolated protein. The zinc-protein was labelled with 125I and then incubated at 37°C with spermatozoa from rat epididymal cauda. Time-dependent in vitro binding of the radioactive protein to sperm cells was demonstrated. This binding was not affected by the presence of proteins from the seminal vesicle during the incubation, while it was blocked in the presence of an excess of unlabelled zinc-protein. After binding, the labelled spermatozoa were treated with a buffer containing 0.5% sodium deoxycholate and 40 mM EDTA; only very small amounts of label were removed from the cells, thus suggesting that the zinc-proteins were kept on the plasma membrane by interactions which do not involve merely hydrophobic bonds
Free radicals and antioxidants in cardiovascular diseases.
No full textIt has been shown that redox homeostasis is important in the pathophysiology of several human diseases, including cardiovascular diseases. In this respect, genetic polymorphism, nutritional and environmental factors, age, lifestyle, and physical activity may account for variable antioxidant defenses, which may be more or less effective in counteracting oxidative damage. Since accumulating oxidative damage may be associated with several pathological conditions, including different cardiovascular diseases, prevention of oxidative stress seems to be a promising approach to improve such diseases. Exercise training, diets rich in antioxidants, and a good control of blood glucose and lipid levels help strengthen the physiological antioxidant defense system, perhaps coupled to drugs capable of increasing the nitric oxide bioavailability and decreasing superoxide production. Within the next few years other therapeutic approaches will be available, such as gene therapy, which will prove to be even more effective but devoid of several important systemic side effects
A zinc-protein from rat prostate fluid binds epididymal spermatozoa
No full textThe detection and the isolation of a zinc-protein from the secretion of the rat dorsolateral prostate is described. The purification procedure, based on gel filtration and cationic exchange chromatography, allowed to separate a minor protein (Mr 66,000) from free zinc ions and other secretory components. Two zinc ions were estimated to be associated with one molecule of isolated protein. The zinc-protein was labelled with 125I and then incubated at 37°C with spermatozoa from rat epididymal cauda. Time-dependent in vitro binding of the radioactive protein to sperm cells was demonstrated. This binding was not affected by the presence of proteins from the seminal vesicle during the incubation, while it was blocked in the presence of an excess of unlabelled zinc-protein. After binding, the labelled spermatozoa were treated with a buffer containing 0.5% sodium deoxycholate and 40 mM EDTA; only very small amounts of label were removed from the cells, thus suggesting that the zinc-proteins were kept on the plasma membrane by interactions which do not involve merely hydrophobic bonds
A major secretory protein from rat seminal vesicle binds ejaculated spermatozoa.
No full textThe rat seminal vesicle produces large amounts of a protein-rich fluid that greatly contributes to semen volume. RSV IV, a protein abundantly secreted from this gland, binds in vitro to rat epididymal spermatozoa. However, there is no evidence that this protein may have an in vivo role as a sperm-coating antigen. We report in this paper that high-molecular-weight RSV IV immunologically related proteins can be detected on ejaculated spermatozoa, but not on epididymal spermatozoa. After incubation of purified RSV IV with ejaculated spermatozoa in freshly recovered semen or with epididymal spermatozoa in a medium containing the coagulating gland secretion, sperm-bound proteins with analogous properties were detected. These results support the hypothesis that RSV IV is modified at ejaculation to an high-molecular-weight, sperm-coating antigen
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