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An integrated proteomic and metabolomic approach reveals peculiar traits in the exocarp of four grape cultivars characterized by a different anthocyanin accumulation
No full textIn order to study the biochemical processes relating to secondary metabolism that occur in berry ripening, a proteomic and metabolomic comparative analysis among four vines characterized by different anthocyanin content was performed. The experiment restricted on skin tissue was conducted by using the 2-DE gels/ LCESI-MS/MS for proteomic investigation and GC-MS in Selected Ion Monitoring mode (SIM) for the metabolomic one. Linear discriminant analysis (LDA) pointed out that the cultivars were distinguishable and the order in which they were grouped mainly reflected their relative anthocyanin contents. The hierarchical clustering analysis clearly showed that in addition to proteins directly linked to anthocyanin biosynthesis also many of those relating to primary metabolism increased in abundance. As far as it concerns metabolomic analysis, only the levels of few key intermediates varied among cultivars in a way that may refer to anthocyanin content. Taken together the results showed that the process of grape ripening in the skin differs in some central metabolic traits among cultivars and that these variations could be linked to differences in secondary metabolism
Analisi proteomica dell'esocarpo della bacca di vite (Vitis vinifera) in relazione agli eventi di maturazione
No full textChanges of the proteome in the grape berry skin during ripening
No full textThe proteome of the skin of grape a berry cultivar widely cultivated in Northern Italy, such as ‘Barbera’, was studied during the ripening of the berry starting from véraison till ripe.
An extraction method suitable to remove interfering compounds was set up. Proteins from cell wall (CWF) and protoplast (PF) fractions were analyzed by bidimensional electrophoresis (2-DE). The LC-ESI-MS/MS approach was used to analyse the PF differentially expressed protein spots.
A total of about 1000 spots were detected. Many spots were present in both protoplast and cell wall fractions, suggesting, as previously reported for tissues of other plant organisms, that cell wall is able to bind protein from other cell fractions. The proteome analysis of the PF shows deep changes in protein expression of grape berry skin during ripening, which involve different metabolisms that are known to be related to berry ripening
Variazioni del pattern proteico e modificazioni post-traduzionali in risposta alla disponibilità di nitrato in piante di mais
No full textLa disponibilità di azoto, presente nei suoli agrari prevalentemente come nitrato, costituisce uno dei principali fattori che determinano la produttività delle specie coltivate. L'assimilazione del nitrato, attiva sia nelle radici che nelle parti aeree, prevede la riduzione ad ammonio e la conversione in amminoacidi. Tale metabolismo presenta interazioni con diversi tratti cellulari ed in particolare con il metabolismo del carbonio, come evidenziato dal reciproco controllo fra l'apparato aereo e radicale. I meccanismi che intervengono nella regolazione coinvolgono modulazioni a livello trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale. Al fine di investigare le variazioni del pattern proteico di foglie e radici di piante di mais (Zea mays L.) in relazione al cambiamento di disponibilità di nitrato è stato condotto uno studio proteomico comparativo, mediante elettroforesi bidimensionale (2-DE) ed analisi LC-ESI-MS/MS, confrontando piante cresciute nelle ultime trenta ore in presenza di nitrato con piante di controllo mantenute nella condizione di carenza. La valutazione di parametri biochimici e fisiologici ha inoltre contribuito a definire lo stato nutriziionale e metabolico delle piante. Le variazioni evidenziate nel proteoma radicale riguardano enzimi dell'assimilazione del nutriente e di processi coinvolti nel suo sostentamento (e.g. ciclo dei pentoso fosfati) ma anche di vie correlate come il metabolismo del NO. Nelle foglie molti degli spots identificati sono risultati essere proteine del metabolismo fotosintetico. I dati ottenuti, unitamente dei parametri fotosintetici, suggeriscono una possibile interazione fra l'espressione dell'enzima lipossigenasi 10, il metabolismo lipidico e la funzionalità cloroplastica. I dati elettroforetici e di spettrometria di massa hannno inoltre messso in luce a modulazione di due differenti modificazioni post-traduzionali dell'enzima PEP carbossilasi (PEPCase) consistenti in una monoubiquitinazione ed in una fosforilazione, rispettivamente nella forma radicale e fogliare dell'enzima. Mediante l'impiego del colorante fluorescente ProQ Diamond, specifico per le proteine fosforilate, è stao possibile evidenziare come la disponibilità di nitrato influenzi lo stato di fosforilazione della PEPCase fogliare che nelle piante C$ è soggetta a controllo circadiano. Per approfondire questi risulati, attualmente si sta procedendo all'ottimizzazzione di protocolli per l'arricchimento cromatografico e l'analisi eletrroforetica delle variazioni post-traduzionali in risposta alla diversa disponibilità di nitrato
Proteomic analysis of iron deficient cucumber roots
No full textextrusion that increase the need for NAD(P)H and ATP respectively, substrates necessary to keep these activities functioning. Recharging of such substrates requires the acceleration of energetic metabolic pathways. Many processes are increased to efficiently sustain the response to iron depletion. In particular, the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase is increased several fold. The rate of carbohydrate catabolism was also increased under these conditions and the activity of several glycolytic enzymes has been shown to be enhanced. Furthermore, other metabolic pathways and free cytosolic enzymatic activities are increased during Fe deficiency, such as some cytosolic NAD(P)+-dependent dehydrogenase belonging to oxidative pentose phosphate pathway.
The proteomic pattern of soluble proteins from roots grown in the presence and in the absence of Fe has been investigated. After setting up a protein method suitable for removing interfering compounds, a 2-DE analysis was performed using a pH 4-7 linear gradient in the first dimension and 10% polyacrilamide homogeneous gels in the second dimension. Using the ImageMaster Platinum software a comparative analysis was then carried out. The LC-ESI-MS/MS approach has been used to analyse the differentially expressed proteins
An integrated proteomic anbd metabolomic approach for the study of exocarp in four grape cultivars with different anthocyanin content
No full textThe great diffusion of techniques relating to high-throughput analysis, as well as the
availability of a complete and high quality draft of the genome sequence of Vitis vinifera,
allowed to deepen the knowledge of grape berry development, necessary assumption in order
to satisfy the new and exigent market claims on product quality.
Through recent transcriptomic and proleomic studies it was shown that the impact of many
sources of variability (e.g. genetical and environmental) during grape development was
underrated, leading to badly generalize the results. A faclor that surely deeply contributes in
distinguishing the composition 01 the cultivars is the effect of Ihe biosynthesis relating to
secondary metabolism during the ripening.
In order to evaluate this aspect, we conducted a ,comparative analysis among four vines
characterized by different anthocyanin content both at the proteomic and metabolomic level.
We decided to locus on mature berry skin, which is the tissue regarded as the richest as far as
it concerns secondary metabolism.
The integration of the results deriving from 2-DE gels LC-ESI-MS/MS and GC-MS
chromatograms relative lo !WO subsequent vintages, emphasized how the differences in the
extent of anthocyanin biosynthesis contribute in markedly influence relevant traits glycolysis,
Krebs cycle and amino acid metabolism
Un approccio integrato proteomico-metabolomico per lo studio delle risposte allo stress idrico di portainnesti di vite
No full textLa selezione di portainnesti di vite con maggiore capacità di tollerare condizioni ambientali sfavorevoli, quali la siccità, è condizionata all’individuazione di marcatori che permettano un’analisi precoce dei genotipi. Molti degli studi condotti hanno focalizzato l’attenzione sulla parte epigea della pianta, mentre scarse sono le informazioni sulle risposte molecolari e fisiologiche dell’apparato radicale. Obiettivo di questo lavoro è stato quello di condurre analisi proteomiche e metabolomiche su radici di due genotipi di vite sottoposti a stress idrico. In dettaglio, sono stati analizzati il genotipo 101.14, portainnesto commerciale, conosciuto come sensibile a questo stress e M4, genotipo risultato dall’incrocio fra 41 B (V. vinifera x V. berlandieri) x V. berlandieri cv. Resseguier n.1, che in un precedente studio in cui sono stati misurati alcuni parametri biochimici
e fisiologici ha mostrato tolleranza alla siccità. Le piante, allevate in vaso su un terreno sabbioso, sono state sottoposte a stress idrico, riducendo l’apporto di acqua fino a raggiungere una capacità di campo del 30 %. Per quanto riguarda l’analisi proteomica, la prima fase è stata dedicata all’ottimizzazione dei protocolli per l’estrazione della frazione proteica che ha portato alla scelta di utilizzare un approccio elettroforetico monodimensionale, abbinato ad un’analisi delle bande mediante uno spettrometro di massa nHPLC-Q-TOF. Le elevate performance analitiche hanno permesso di identificare e quantificare oltre 1300 proteine. Le analisi metabolomiche, condotte mediante GC-MS seguite da tecniche di deconvoluzione e di batch quantification degli spettri, ricorrendo ad una libreria di composti trimetilsilil-derivatizzati del Golm Metabolome Database, hanno permesso di identificare e quantificare in termini relativi oltre 100 metaboliti. I risultati ottenuti evidenziano profondi cambiamenti del metabolismo e hanno permesso di descrivere peculiari tratti di tolleranza allo stress idrico.
Lavoro supportato da “Progetto AGER- SERRES”, grant n°2010-2105
Cambiamenti del proteoma della bacca di vite (Vitis vinifera) durante la maturazione
No full textLa maturazione dell’uva coinvolge molteplici eventi biochimici e fisiologici che modificano profondamente le caratteristiche della bacca. Durante questo processo, che inizia all’invaiatura, si osservano, fra l’altro, cambiamenti strutturali della parete, l’aumento delle dimensioni del frutto, ascrivibile ad una crescita per distensione cellulare, ed il rammollimento del pericarpo. A questi eventi si accompagnano modificazioni nella composizione dei metaboliti, quali l’accumulo di zuccheri, amminoacidi e potassio, la riduzione degli acidi organici, principalmente dell’acido malico, e la comparsa di metaboliti secondari, quali tannini ed antociani.(Robinson SP and Davies C “Molecular biology of grape berry ripening” Australian journal of grape and wine research 6: 175-188; 2000).
A dispetto del grande interesse per questa specie, poco conosciuti rimangono i processi molecolari e biochimici attivi durante la maturazione di questo frutto non climaterico. La presenza di elevate concentrazioni di alcuni metaboliti, quali ad esempio i composti fenolici, rende infatti particolarmente difficoltosa l’individuazione di metodiche adeguate per questo materiale sperimentale. Mentre alcune informazioni, seppure incomplete, sull’attività trascrizionale sono tuttavia ora disponibili, il profilo d’espressione proteica nelle diverse fasi di maturazione rimane pressoché sconosciuto. L’incremento delle conoscenze sul genoma di vite ottenute in questi ultimi anni ha comunque creato i presupposti necessari per avviare studi di proteomica. In questo contesto va evidenziato come la fase d’estrazione richieda una particolare attenzione. Precedenti ricerche, condotte su frutti di altre specie vegetali, hanno infatti riscontrato che molte proteine possono legarsi alla componente glucosidica della parete con conseguente creazione di artefatti; in questo contesto appare quindi prioritario studiare il profilo d’espressione proteica nelle diverse frazioni cellulari (Rose JKC et al. “Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools” The Plant Journal, 39, 715-733, 2004).
Primo obbiettivo di questo lavoro è stato quello di individuare il protocollo più idoneo per l’estrazione delle proteine del protoplasto e della parete dell’esocarpo della bacca di vite, tessuto in cui viene sintetizzata la maggiore parte dei metaboliti secondari. I risultati ottenuti dall’analisi elettroforetica bidimensionale (2D-PAGE) hanno evidenziato che i campioni estratti in tampone e purificati mediante ripartizione con fenolo, precipitazione con ammonio acetato in metanolo e successivi lavaggi in acetone presentano, per entrambe le frazioni, il maggiore numero di spot rispetto ad altri protocolli testati. Circa il 15% dei peptidi sono risultati presenti in entrambe le frazioni, confermando come la procedura di estrazione incida sulla composizione dei diversi proteomi.
La ricerca è quindi proseguita studiando i profili proteici nelle diverse fasi di maturazione. L’analisi 2D-PAGE ha rivelato evidenti cambiamenti d’espressione di alcuni peptidi che sono stati quindi analizzati mediante spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS, liquid chromatography – Electrospray - tandem mass spectrometry). I risultati ottenuti, seppure ancora preliminari, evidenziano le potenzialità di questo approccio sperimentale per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei i profondi cambiamenti biochimici e fisiologici che caratterizzano la maturazione della bacca di vite
Risposte allo stress idrico in due portainnesti di vite con diversa suscettibilità : uno studio proteomico e metabolomico
No full textI portainnesti di vite attualmente disponibili appaiono essere un limite per l’attuale viticultura, poiché non sempre rispondono alle esigenze dettate dalle peculiari caratteristiche pedoclimatiche degli areali viticoli, spesso molto diversi fra loro. Un fattore emergente è rappresentato dalla siccità che, nonostante la vite sia una specie mediamente resistente a questo stress, richiede l’individuazione di genotipi in grado di meglio gestire il bilancio idrico in condizioni di scarsa disponibilità di acqua.
Precedenti studi hanno permesso di caratterizzare due genotipi, 101.14, portainnesto commerciale sensibile alla siccità e M4, genotipo risultato dall’incrocio 41 B (V. vinifera x V. berlandieri) x V. berlandieri cv. Resseguier n.1, risultato più tollerante a questo stress. Lo studio era stato condotto confrontando una condizione di controllo, ottenuta mantenendo le piante in vaso con la capacità di campo all’80%, con una condizione in cui la disponibilità idrica era ridotta progressivamente fino ad una capacità di campo del 30%.
In questo studio, utilizzando il medesimo modello sperimentale, si è proceduto all’analisi mediante un approccio integrato proteomico/metabolomico delle risposte metaboliche indotte dalla carenza idrica.
Per quanto riguarda l’analisi proteomica, la prima fase è stata dedicata all’ottimizzazione dei protocolli per l’estrazione della frazione proteica che ha portato alla scelta di utilizzare un approccio elettroforetico monodimensionale, abbinato ad un’analisi delle bande mediante uno spettrometria nLC-nESI-MS/MS. Le elevate performance analitiche hanno permesso di identificare e quantificare oltre 1300 proteine. Le analisi metabolomiche, condotte mediante GC-MS seguite da tecniche di deconvoluzione e di batch quantification degli spettri, ricorrendo ad una libreria di composti trimetilsilil-derivatizzati del Golm Metabolome Database, hanno permesso di identificare e quantificare in termini relativi oltre 100 metaboliti. I risultati ottenuti evidenziano profondi cambiamenti del metabolismo in risposta allo stress idrico. Nel medesimo tempo lo studio ha permesso di evidenziare alcuni tratti peculiari a cui è possibile riferire la maggiora capacità di tollerare questa condizione sfavorevole da parte di M4.
Ricerca finanziata dal Progetto AGER-SERRES, pratica n°2010-210
Proteomic Comparison of Fruit Ripening between 'Hedelfinger' Sweet Cherry (Prunus avium L.) and Its Somaclonal Variant 'HS'
No full textThe somaclonal variant HS, from sweet cherry (Prunus avium L.) 'Hedelfinger' (H), was previously selected for reduced tree vegetative vigor and lesser canopy density. In this work, we compared H and HS fruits at early unripe (green) and full ripe (dark red) stages by biochemical and proteomic approaches. The main biochemical parameters showed that fruit quality was not affected by somaclonal variation. The proteomic analysis identified 39 proteins differentially accumulated between H and HS fruits at the two ripening stages, embracing enzymes involved in several pathways, such as carbon metabolism, cell wall modification, stress response, and secondary metabolism. The evaluation of fruit phenolic composition by mass spectrometry showed that HS sweet cherries have higher levels of procyanidin, flavonol, and anthocyanin compounds. This work provides the first proteomic characterization of fruit ripening in sweet cherry, revealing new positive traits of the HS somaclonal variant
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