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がん浸潤における細胞運動とMMP発現の協調的制御機構の解析
Full text linkFAKはファイブロネクチン刺激によりErkおよびJNKを活性化する。このMAPK活性化は細胞増殖、細胞分化、細胞運動の制御に必要である。最近同定されたMAPKのScaffold protein(JSAP1)はMAPK、MAPKK、MAPKKKと結合することでJNK活性化の足場として反応を促進する。一方でErk活性化に対しては抑制的に働きシグナル伝達の特異性を規定する因子であると考えられる。
(結果)インテグリン/FAKを介した情報伝達系におけるJSAP1の役割を検討した。JSAP1はFAKのN-末端と結合し、FAK-Src複合体形成にともないFAKへの結合増大、チロシンリン酸化されることが分かった。このJSAP1のチロシンリン酸化はY397F-FAK変異体の発現やSrcの不活性化により減少し、細胞をファイブロネクチンで刺激することでも誘導された。また、JSAP1を発現させることによりファイブロネクチン上でのcell spreadingが亢進され、この作用にはJSAP1のチロシンリン酸化が必要であった。以上の結果、FAKがJSAP1を細胞接着斑にリクルートし、Srcがチロシンリン酸化し、cell spreadingを亢進するものと考えられた。FAKはJSAP1を介してより選択的にMAPKを制御し、細胞増殖、細胞分化、細胞運動を調節していると考えられる。
(考察)ファイブロネクチンによる細胞刺激はインテグリンの集積とFAKの自己リン酸化を引き起こす。この自己リン酸化はSrcおよびPI-3 kimaseとの複合体形成だけでなく、p130casなどの多くの情報伝達分子のリン酸化、集積を誘導する。この結果MAPKおよびPI-3 kinaseの活性化を惹起し、cell spreadingや細胞運動を誘導すると考えられる。本研究でFAK/Src複合体とJSAP1の関与を証明できたことはFAKがJSAP1を細胞接着斑にリクルートすることでより選択的にMAPKを制御し、細胞増殖、分化、運動などの機能を調節している可能性を示唆している。JSAP1のファイブロネクチン上でのcell spreadingを亢進する作用がMAPKの活性化とどの様な関係にあるのか、またどの分子との会合がcell spreadingの亢進に必要なのか、細胞運動およびMMP活性発現に対する作用も検討する予定である。研究課題/領域番号:13216039, 研究期間(年度):2001出典：「がん浸潤における細胞運動とMMP発現の協調的制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号13216039
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13216039/)を加工して作成金沢大学がん進展制御研究所research repor
がん細胞運動とマトリックスメタロプロテアーゼ活性発現の協調的制御機構の解析
Full text link細胞外マトリックス分解と細胞運動の協調的制御が癌の浸潤・転移の成立するに必須である。しかし、その協調的制御機構については未だよくわかっていない。本研究では癌浸潤・転移に重要な役割を担うMT1-MMPの細胞運動における役割を解析した。MT1-MMPを発現しているHT1080細胞をI型コラーゲン上に接着させるとERK活性化、MMP-2活性化、MT1-MMP活性発現、細胞運動が誘導される。MT1-MMP遺伝子導入はコラーゲンにより誘導される細胞運動およびERK活性化を亢進した。MMP阻害剤とMEK阻害剤はコラーゲン上の細胞運動とERK活性化を抑制し、活性型MEK遺伝子導入により誘導される細胞運動とMMP-2の活性化はMMP阻害剤で抑制された。また、MT1-MMPのヘモペキシンドメインの過剰発現はコラーゲン上でのERK活性化、MMP-2活性化、細胞運動を抑制した。以上の結果からI型コラーゲンによるERK活性化とMT1-MMP活性発現誘導間の正のフィードバック機構の存在が考えられた。また、本研究では4回膜貫通型分子CD63がMT1-MMPと結合し、MT1-MMPのリソゾームでの分解を促進することでMT1-MMP活性を負に制御することも報告した。
さらに、本研究ではインテグリン/FAK/p130^による細胞運動誘導情報伝達機構におけるアダプター分子Crkの役割も解析した。CrkIIは221番チロシンがリン酸化されるとSH2ドメインを介して分子内結合し、アダプター分子としての活性を失う。この221番リン酸化チロシンを脱リン酸化酵素の一つPTP1Bが脱リン酸化することが細胞運動亢進に重要であることを証明した。また、221番チロシンが存在しないCrkIIのスプライシング変異体であるCrkIの発現が脳腫瘍組織で亢進しており、細胞におけるCrkI発現がp130^のリン酸化、Akt活性化を誘導する結果、グリオーマの細胞運動・浸潤能を増強させることも明らかにした。研究課題/領域番号:14770059, 研究期間(年度):2002-2003出典：「がん細胞運動とマトリックスメタロプロテアーゼ活性発現の協調的制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号14770059
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
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癌細胞運動とマトリックスメタロプロテアーゼ活性発現調節機構の解明
Full text link癌抑制遺伝子PTEN(phosphaatase aand tensin homologue deleted on chromosome10)は悪性腫瘍の悪制度と相関して変異・欠質が認められる。PTENの活性は細胞膜への移行およびPTENタンパクの安定性により制御されていると考えられる。このPTEN活性の制御にはそのカルボキシル末端が重要な役割を担っており、PTEN活性の制御機構を解明するためにPTENのカルボキシル末端をバイトにしてYeast Two-Hybrid法にてスクリーニングを行った。
(結果)既知の4回膜貫通型分子とアクチン結合分子が同定された。培養細胞を用いた過剰発現系にて4回膜貫通型分子、アクチン結合分子とPTENの結合が免疫沈降法により確認された。この4回膜貫通型分子はC-末端の細胞内ドメインを介してPTENと結合することがわかった。また、アクチン結合分子はアクチン結合部位とは異なる部位でPTENと結合することがわかった。PTENのPI3-K/Akt経路抑制作用に対する4回膜貫通型分子ととアクチン結合分子の効果を抗リン酸化Akt抗体によるウエスタンプロッティングにて検討した。その結果、PTENによるAktのリン酸化抑制は4回膜貫通型分子と共発現することで増強された。
(考察)
インテグリン/FAK経路は細胞増殖、細胞分化、細胞運動を制御していおり、癌細胞浸潤機構解明の鍵であると考えられる。PTENはこのFAKの397番目チロシンを直接脱リン酸化することでFAKの活性を抑制し、PIP3を脱リン酸化することでも細胞運動を抑制する。最近、PTENのカルボキシル末端は膜への移行と安定性を制御していることが明らかになり、PTENのカルボキシル末端結合タンパクがPTENの活性を制御していると考えられる。今回PTEN結合分子として同定された4回膜貫通型分子はインテグリンと結合し細胞運動を制御していること、アクチン結合分子は細胞骨格形成に関与していることが報告されている。これらの経路にPTENがどの様に関与しているのか、FAKのリン酸化、MMPの活性発現に関与しているのかを今後検討する予定である。研究課題/領域番号:12770071, 研究期間(年度):2000-2001出典：「癌細胞運動とマトリックスメタロプロテアーゼ活性発現調節機構の解明」研究成果報告書 課題番号 12770071（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12770071/)を加工して作成金沢大学がん進展制御研究所research repor
膜型マトリックスメタロプロテアーゼによる細胞運動極性 制御機構
Full text linkがん細胞浸潤は細胞外マトリックス(ECM)分解と方向性を持った細胞運動誘導が協調的に制御され、かつシグナルの連続性が維持されて初めて成立する。がん細胞はECM由来の細胞運動誘導シグナルの連続性を確保するため、ECM分解酵素を用いて細胞外環境を調節している。本研究では膜型マトリックスメタロプロテアーゼ(MT1-MMP)による細胞運動・浸潤時の極性形成と連続性維持への関与とその作用機序をインテグリン/FAK情報伝達経路を中心に解明し、がんの浸潤・転移機構の解明とその阻止に向けた標的分子の同定と薬剤開発を目標とする。
MT1-MMPと細胞運動および浸潤極性
イヌ腎上皮MDCK細胞やヒト乳癌MCF-7細胞のコラーゲンゲル培養において、MT1-MMPを発現させることによりFAKとERKのリン酸化が亢進することを明らかにした。このリン酸化の亢進は、MMP阻害剤処理や腫瘍細胞のMT1-MMPをsiRNAを用いてknockdownすることにより抑制された。また、MT1-MMP阻害はインテグリンαvβ3を介したc-Srcの活性化も抑制することも見出した。事実、Src阻害剤処理やsiRNAを用いたc-Srcのknockdownは、MT1-MMP活性に影響を与えずにFAKやERKのリン酸化を抑制した。c-Srcのエフェクター分子を検索したところ、コラーゲンゲル内においてPaxillinのknockdownがERK活性化と細胞増殖を抑制することが判明した。MT1-MMPとPaxillinの共発現はコラーゲンゲル内でのERK活性化を誘導した。MT1-MMPを発現している癌細胞の3次元コラーゲンゲル内増殖にはMT1-MMP活性に加えて、c-Srcの基質であるパキシリンが重要であることが判明した。MT1-MMPによる細胞増殖シグナル活性化の足場としてパキシリンが働いていることが期待される。研究課題/領域番号:20013017, 研究期間(年度):2008 – 2009出典：研究課題「膜型マトリックスメタロプロテアーゼによる細胞運動極性 制御機構」課題番号20013017
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-20013017/）を加工して作成金沢大学がん進展制御研究所research repor
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
がん浸潤の細胞運動と細胞外マトリックス分解機構の解析
Full text link細胞外マトリックス分解と細胞運動が協調的に作用してがんの浸潤・転移が成立する。この協調作用は細胞運動の極性形成と密接に関与していると考えられる。本研究ではMT1-MMPおよびJNK情報伝達経路の構成分子とJNK結合分子の細胞運動における役割を調べた。
ヒト線維肉腫細胞株HT1080をI型コラーゲン上に接着させることによりERK活性化、MMP-2活性化、MT1-MMP活性発現、細胞運動が誘導された。HT1080細胞におけるMT1-MMPの過剰発現は細胞運動およびERK活性化を亢進した。この細胞運動とERK活性化はMMP阻害剤とMEK阻害剤により抑制され、活性型MEK発現により誘導される細胞運動とMMP-2の活性化はMMP阻害剤でともに抑制された。また、MT1-MMPを遺伝導入した上皮細胞をコラーゲン上で培養し上皮細胞成長因子で刺激すると、対照細胞に比べてERK活性化が亢進することが判明した。上皮細胞増殖因子により誘導される細胞運動におけるMT1-MMP活性の役割を現在検討中である。MT1-MMPは恐らく細胞接着斑形成に関与することでI型コラーゲン上における上皮細胞増殖因子の情報伝達経路に影響を及ぼしていると考えられる。
JNK足場蛋白であるJSAP1のグリオーマ細胞株における発現はFAKの活性化を導き、その結果p130Casのリン酸化を誘導した。この結果と一致してJSAP1発現はフィブロネクチン刺激によるJNK活性化を亢進した。さらにJSAP1発現はフィブロネクチン上におけるJNK依存的細胞運動を誘導し、JNK結合部位を欠失したJSAP1変異体では細胞運動・JNK活性化誘導は認められなかった。JSAP1mRNAの発現はグリオーマ細胞株の運動能、ヒト脳腫瘍の悪性度と相関して上昇していた。以上のことからJSAP1は悪性腫瘍の浸潤・転移能獲得に関与していると考えられた。研究課題/領域番号:16022227, 研究期間(年度):2004出典：「がん浸潤の細胞運動と細胞外マトリックス分解機構の解析」研究成果報告書 課題番号16022227
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
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Analysis of regulatory mechanism for cell polarity formation by JNK binding molecules during migration
Full text linkFAK活性はJSAP1とp130casの共発現により増強され、その結果JSAP1とp130casのリン酸化を亢進した。JSAP1をグリオーマ細胞株U87MG細胞に遺伝子導入するとJNKのリン酸化が誘導され、fibronectin(FN)上での細胞運動が亢進された。しかし、JNK結合部位を欠質したJSAP1変異体発現では細胞運動の亢進は認められなかった。JSAP1を遺伝子導入した細胞の運動先端部にJNKとJSAP1の集積が認められ、細胞運動はJNK阻害剤により抑制された。また、脳腫瘍組織を用いてMAPK足場蛋白(JIP-1,-2,JSAP1)のmRNA発現を検討した結果、JSAP1の発現と悪性度に正の相関が認められた。JSAP1は運動細胞の先端部にJNKを誘導し、FAKを介したJNK活性化経路を亢進することにより細胞運動を調節していると考えられた。 また、HT1080細胞のI型コラーゲンおよびFN上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され、ECM分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方MT1-MMPの過剰発現はECM分解、細胞運動と細胞接着斑のturnoverの亢進を誘導し、dominant-negative体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制する一方で、FAKの自己リン酸化(チロシン397番)を亢進していた。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化、FAKの自己リン酸化を調節することにより細胞接着斑、細胞運動を制御していることが示唆された。 細胞運動時の極性形成・維持機序は方向性を持った細胞運動およびその延長線上にあるがん浸潤・転移の機構を解明する上で重要である。JNK結合分子は細胞接着斑におけるJNKの局在と活性化部位を誘導することで細胞運動時の極性形成・維持を制御していると予想される。また、MT1-MMPによるECMの分解・再編をともなった微小環境の整備が細胞極性形成・維持に密接に関与していると推測される。ECMにおける極性を有した細胞運動とMT1-MMP活性発現の協調的な制御機構を解明することは、がんの浸潤・転移阻止の標的分子の同定、薬剤開発に貢献できるものと思われる。JNK/SAPK-associated protein 1(JSAP1) mediated an association between focal adhesion kinase (FAK) and JNK, which was induced by either co-expression of Src or attachment of cells to fibronectin (FN). Complex formation of FAK with JSAP1 and p130 Crk-associated substrate (p130^) resulted in augmentation of FAK activity and phosphorylation of both JSAP1 and p130^, which required p130^ hyperphosphorylation and was abolished by inhibition of Src. JNK activation by FN was enhanced by JSAP1, which was suppressed by disrupting the FAK/p130^ pathway by expression of a dominant-negative form of p130^ or by inhibiting Src. JSAP1 was co-localized with JNK and phosphorylated FAK at the leading edge and stimulated of cell migration, which depended on its JNK binding domain and was suppressed by inhibition of JNK. The level of JSAP1 mRNA correlated with advanced malignancy in brain tumors, unlike other JIPs. We propose that the JSAP1/FAK complex functions cooperatively as a sc affold for the JNK signaling pathway and regulator of cell migration on FN, and we suggest that JSAP1 is also associated with malignancy in brain tumors.
MT1-MMP expression promoted FN-induced cell migration, which was accompanied by FN degradation and reduction of stable focal adhesions, which function as anchors for actin-stress fibers, and attenuated integrin clustering. The attenuation of integrin clustering was abrogated by MT1-MMP inhibition. When cultured on fibronectin, HT1080 cells, which endogenously express MT1-MMP, showed so-called motile morphology with well-organized focal adhesion formation, well-oriented actin-stress fiber formation and the lysis of FN through trails of cell migration. Inhibition of endogenous MT1-MMP resulted in the suppression of FN lysis and cell migration and promotion of stable focal adhesion formation concomitant with enhanced phosphorylation of tyrosine 397 of FAK and reduced ERK activation. These results suggest that lysis of the extracellular matrix by MT1-MMP promotes focal adhesion turnover and subsequent ERK activation, which in turn stimulates cell migration.研究課題/領域番号:16590241, 研究期間(年度):2004–2005出典：「JNK結合分子による細胞運動極性制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号16590241
(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)
本文データは著者版報告書より作成research repor
癌細胞浸潤における細胞運動とMT-MMPの協調的制御機構の解析
Full text link細胞外マトリックス分解と細胞運動が協調的に作用して癌の浸潤・転移が成立するが、その協調的制御機構については不明な点が多い。そこで本研究ではMT1-MMPの細胞運動における役割を解析した。HT1080細胞をI型コラーゲン上に接着させることでERK活性化、MMP-2活性化、MT1-MMP活性発現、細胞運動が誘導され、MT1-MMPの過剰発現は細胞運動およびERK活性化の亢進を誘導した。MMP阻害剤とMEK(MAPKK)阻害剤によりこの細胞運動とERK活性化は抑制され、活性型MEK発現により誘導される細胞運動とMMP-2の活性化はMMP阻害剤で抑制された。また、MT1-MMPのヘモペキシンドメインの過剰発現はI型コラーゲンによるERK活性化、MMP-2活性化、細胞運動を抑制した。これらの結果からI型コラーゲンによるERK活性化とMT1-MMP活性発現誘導間の正のフィードバック機構の存在が明らかとなった。また、本研究では4回膜貫通型分子CD63がMT1-MMPと結合し、MT1-MMPのリソゾームでの分解を促進することでMT1-MMP活性を負に制御すること、MT1-MMPが細胞膜接着分子Syndecan 1を切断することで細胞運動を制御していることも見出した。
本研究ではインテグリン/FAK/p130^による細胞運動誘導情報伝達機構におけるアダプター分子Crkの役割も解析した。CrkIIは221番チロシンがリン酸化されるとSH2ドメインを介して分子内結合し、アダプター分子としての活性を失う。この221番リン酸化チロシンを脱リン酸化酵素の一つPTP1Bが脱リン酸化することが細胞運動亢進に重要であることを本研究で証明した。また、負の制御を受けないCrkIIのスプライシング変異体であるCrkIの発現が脳腫瘍組織で亢進しており、細胞におけるCrkI発現がP130^のリン酸化、Akt活性化を誘導することで細胞運動・浸潤能を増強させることも見出した。研究課題/領域番号:15024225, 研究期間(年度):2003出典：「癌細胞浸潤における細胞運動とMT-MMPの協調的制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号15024225
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15024225/)を加工して作成金沢大学がん進展制御研究所research repor
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
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