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肝脏再生的跨尺度多模态力学调控
No full text目的 肝脏具有很强的再生能力,肝组织力学微环境的变化是调控肝脏损伤与再生的重要因素,其调控机制目前尚不清楚。肝血窦是肝脏微循环的基本单元,具有独特的细胞组成、结构和生理力学特征。本文通过体内与体外研究相结合,实现跨尺度、多模态力学调控,探索肝血窦的流体剪切、周向拉伸和基质硬度对肝系细胞表型和功能的影响。方法 采用小鼠肝脏灌注、部分肝切除、肝纤维化模型等在体实验方法,微流控芯片、细胞周期性拉伸、硬度可调的聚丙烯酰胺水凝胶等体外生物力学方法,及原代细胞表型、功能和信号转导等离体检测手段。结果 针对流体剪切对肝再生的促进作用,发现剪切应力可通过β1整合素激活FAK,抑制Hippo通路,促进YAP激活细胞周期蛋白的表达,上调肝细胞增殖潜能。针对力学拉伸对肝再生的促进作用,发现力学拉伸可通过β1整合素诱导肝血窦内皮细胞(LSEC)内F-actin重组和YAP的核转位,上调HB-EGF的表达,继而通过旁分泌促进肝细胞增殖。针对基质硬度对LSEC去分化的调控作用,发现硬基底可通过FAK-p38通路促进LSEC去分化,为肝纤维化治疗提供了新的治疗靶点。结论 研究结果可为深入理解多模态力学因素在肝脏损伤与修复中的作用提供基础,为肝纤维化等疾病的防治提供新思路
力学因素调控肝血窦内皮细胞去窗孔化的生物力学机制
No full text目的 肝血窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)是肝内特化的内皮细胞,其独特的窗孔结构是肝脏稳态维持的必要条件。LSEC去窗孔化是促进肝纤维化发展的重要因素,而基质硬度和膜张力等力学因素能否直接调控LSEC去窗孔化目前尚不清楚。方法 构建小鼠肝纤维化模型及硬度可调的水凝胶,并采用原子力显微镜量化窗孔的数量和大小,分析基质硬度调控LSEC去窗孔化的力学转导机制;通过改变溶液渗透压调节细胞膜张力,使用Flipper-TR探针量化膜张力的变化,并利用超分辨成像观测活细胞窗孔动态变化,探究膜张力对窗孔形成的调控作用。结果 随着基质硬度的增加,LSEC窗孔的数量显著下降。硬基底可促进FAK、p38及下游信号分子的磷酸化,诱导F-actin骨架重组,促进LSEC去窗孔化。随肝纤维化的发展,LSEC窗孔减少,而抑制FAK或p38可促进肝纤维化早期LSEC的窗孔恢复。高渗或抑制F-actin聚合可使LSEC的细胞膜张力减小,窗孔数量增加。结论 基质硬度可通过FAK、p38调控LSEC的骨架重组及去窗孔化,而膜张力的减小可促进LSCE窗孔形成。以上研究为肝纤维化的早期治疗提供了新靶点和新思路
流体剪切应力对肝细胞分区的调控作用
No full text目的 肝细胞的空间异质性和代谢是肝脏有序执行其生理功能的基础,肝小叶内沿汇管区向中央静脉区方向可将肝细胞分为三区:一区主要参与糖异生、蛋白合成,二区负责铁调素的分泌,而三区执行糖酵解、脂肪生成等功能。间隙流剪切应力是调控肝细胞增殖和代谢的重要因素,其是否参与了肝细胞分区的形成,目前尚不清楚。方法 采用两步胶原酶灌流方法提取原代小鼠肝细胞,通过微流控芯片施加不同大小的剪切应力,检测分区标志物和代谢功能的变化,分析流体剪切应力对肝细胞分区的调控作用。结果 发现低剪切应力(0.005～0.05 dyn/cm2)可促进一区标志物E-钙黏素的表达,增加白蛋白分泌和糖原合成,同时上调葡萄糖-6-磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶1等糖异生、尿素生成关键酶的表达;而高剪切应力(0.5～5 dyn/cm2)可上调脂肪生成相关基因的表达,促进脂滴堆积,同时增加细胞色素P450酶、己糖激酶等药物代谢和糖酵解关键酶的表达。结论 肝细胞分区受到剪切应力的调控,低剪切应力可促进肝细胞一区功能的执行,高剪切有利于肝细胞三区功能的执行
细胞-细胞间作用力调控肝脏类器官的构筑与功能
No full text目的 肝脏类器官是一种干细胞来源经自组织形成的三维细胞结构,可在体外重现肝脏的发生过程、模拟肝脏的组织结构、生理功能及病理状态,具有重要的基础意义和广阔的应用前景。目前尚不清楚在肝脏类器官形成过程中干细胞在相同的生化条件下可分化为不同种类终末细胞的原因,推测在类器官形成过程中细胞间作用力分布不均匀可能导致干细胞命运的不同。本研究旨在探讨细胞-细胞间作用力调节肝脏类器官结构和功能的生物力学机制。方法 将人肝祖细胞(Hepa RG细胞系)包埋在基质胶中进行特定阶段诱导分化获得肝脏类器官。通过免疫荧光检测肝细胞和胆管细胞标志物的表达以确定它们在肝类器官中的分布,并构建DNA分子力学探针用于细胞间作用力大小和分布的原位观察。结果Hepa RG来源肝脏类器官经生长分化后可检测到肝细胞标志物ALB和CK18及胆管细胞标志物CK19的表达增加,干细胞标志物SOX9表达减少。CK18分布在肝类器官内部而CK19分布在边缘位置。使用3种类型的细胞间作用力探针(4.7、9.8和16.3 p N)检测类器官内部的细胞间力,发现类器官核心区域的细胞间力显著高于边缘区域。结论 肝脏类器官形成过程中,肝祖细胞向肝细胞与胆管细胞的双向分化能力与细胞间力大小不同有关,较强的胞间力更有利于向肝细胞分化
基于(类)器官芯片研究肝脏疾病的力学调控机制
No full text目的 肝脏是人体的重要器官,具有合成、代谢、免疫等多种功能,其结构、细胞组成及力学微环境复杂。现有的肝脏体外模型,如二维培养和类器官,在复现多细胞组成、三维组织结构和力学微环境方面仍有诸多不足,限制了肝脏疾病的发病机理研究和治疗手段研发。方法 为了解决目前体外模型难以复现多细胞、多组织界面的问题,本研究将器官芯片技术和类器官相结合:构建了复现肝血窦和狄氏间隙结构、整合了4种肝系细胞的肝血窦芯片;在天然基质材料中构建了三维管状的胆管芯片,并结合胆管类器官,发展了人源血管化胆管类器官芯片。结果 三维肝血窦芯片高度还原了肝血窦几何结构、细胞组成和流体剪切力学微环境,揭示了多细胞互作和血流剪切调控肝脏功能稳态和免疫应答的新机制,并应用肝再生中力学调控机制的研究;胆管芯片高度还原了胆管的三维结构以及生理功能,阐释了流动剪切下胆管的损伤及保护机制;人源血管化胆管类器官芯片高度还原了三维组织界面、流体剪切与免疫响应,帮助阐释了胆汁淤积性肝病的发病机理。结论 通过构建上述多种结构与力学可控的肝脏器官芯片,可在体外高度还原肝脏生理微环境,为深入认识力学因素影响肝脏生理病理功能的调控机制、寻找肝脏疾病的治疗新思路提供基础
基于肝脏类器官芯片研究纤维化微环境调控慢性肝损伤修复
No full text目的 在慢性肝损伤的修复中,以胆管细胞的激活与增殖为特征的导管反应起着重要作用,并与肝纤维化密切相关。导管反应激活间质细胞,促进胞外基质的沉积、重塑肝脏微环境,从而影响肝脏祖细胞增殖、分化,然而纤维化的微环境,尤其是力学微环境,如何影响肝祖细胞的增殖和分化的机制,目前仍不清楚。方法 通过结合微制作与类器官技术,利用间质细胞自组织形成拉伸加载下的纤维化微组织,实现与肝脏类器官的共培养,还原纤维化微环境中的导管反应。通过悬臂梁刚度、基质成分和细胞密度调控并实时观测微组织的收缩力,加入炎症因子或与中性粒细胞共培养能够模拟肝纤维化中的免疫反应。结果 本文实现了肝脏类器官与间质细胞的共培养及微组织形成,间质细胞通过细胞重排和基质重塑形成纤维化微环境。通过分子标志物及输运功能对肝祖细胞及间质细胞的共培养进行表征,发现纤维化微环境不仅对微组织施加拉伸力,并且造成肝脏类器官的拉伸。在慢性肝损伤相关炎性因子的刺激下,纤维化组织会进一步收缩,增加肝脏类器官增殖。结论 本研究创新性构建了纤维化类器官芯片,为理解肝纤维化和导管反应的复杂相互作用提供了体外研究模型,助力阐释纤维化微环境对慢性肝损伤修复的影响与调控机制
中性粒细胞曳尾结构形成的力学-生物学耦合机制
No full text目的 中性粒细胞(PMN)迁移过程中留下富含整合素和细胞因子的曳尾结构(trail),进而重塑局部组织微环境,调节机体的适应性免疫应答;然而,PMN的曳尾结构形成的机制尚不清楚。本文从力学免疫学的角度,探究PMNs在管腔内迁移过程中曳尾形成规律及基底调控机制,并考察了曳尾对树突状细胞募集和免疫功能的调控。方法 通过荧光抗体对PMN的标志性分子Ly6G进行标记,体外监测PMN在爬行过程中曳尾的形成,利用免疫荧光技术表征曳尾形貌及其黏附分子及骨架相关蛋白的含量和分布;采用微流道和不同黏附性表面,考察了流体剪切和黏附对曳尾生成的影响。结果 研究发现,曳尾是PMNs在迁移过程中留下的富含整合素的膜性囊泡结构,含有大量细胞因子但是并不包含细胞骨架连接蛋白。曳尾的形成依赖于细胞与基底之间的二维相互作用,通过差异化调控beta2整合素CD11a和CD11b的分布和表达介导了曳尾的形成;流体剪切和基底黏附性差异可以影响曳尾生成。DCs能够通过其表面的CD54与曳尾上的beta2整合素发生受体-配体相互作用,并引起自身释放更多的趋化因子,影响DCs的表型并调控DCs启动CD8~+T细胞为主的适应性免疫应答。结论 中性粒细胞曳尾的生成可能是控制炎症的新策略,可为未来靶向性调控中性粒细胞迁移和功能提供新思路
旋转培养通过YAP核转位调节HepaRG来源肝脏类器官的形成
No full text目的 肝脏是人体碳水化合物和脂质代谢、解毒和蛋白质合成的主要枢纽,太空微重力环境可以造成肝脏生理力学环境变化,影响肝脏组织形态、细胞的增殖分化,甚至导致肝脏功能异常,但其影响机制尚不完全清楚。肝脏类器官是肝脏生理、病理研究的有效体外模型,结合地面旋转培养装置可研究微重力条件对肝脏类器官构建的影响。方法 使用自行研制的扁平腔室旋转培养系统(RFC)研究地面旋转条件对肝祖细胞(Hepa RG细胞系)来源肝脏类器官构建的影响。将Hepa RG与基质胶混匀后接种到RFC培养腔室中,以10 r/min的速度培养7天,同时以静止腔室培养的肝脏类器官作为对照。使用免疫荧光、q PCR、组学分析等方法阐明地面旋转条件对肝脏类器官构建的力学-生物耦合规律和机理。结果 旋转组中肝脏类器官较对照组生长速度更快,形成的类器官投影面积更大。RNA-seq结果表明旋转组中肝脏类器官干性标志物(如SOX9和CD44)表达增加,该结果与q PCR和Simple western检测结果一致。旋转组中细胞表面整合素α6β4表达上升,由此介导YAP表达与核转位增强。使用维替泊芬(VP)抑制YAP核转位不利于肝类器官的干性维持。结论 旋转培养可促进肝脏类器官的生长;通过促进细胞表面整合素α6β4表达增强YAP表达和核转位进而增强Hepa RG细胞来源肝脏类器官的多潜能性
Mechanically Regulated Outside-In Activation of an I-Domain-Containing Integrin
No full textIntegrins are heterodimeric transmembrane proteins that mediate cellular adhesion and bidirectional mechanotransductions through their conformational allostery. The allosteric pathway of an I-domain-containing integrin remains unclear because of its complexity and lack of effective experiments. For a typical I-domain-containing integrin alpha(x)beta(2), molecular dynamics simulations were employed here to investigate the conformational dynamics in the first two steps of outside-in activation, the bindings of both the external and internal ligands. Results showed that the internal ligand binding is a prerequisite to the allosteric transmission from the alpha- to beta-subunits and the exertion of external force to integrin-ligand complex. The opening state of alpha l domain with downward movement and lower half unfolding of alpha(7)-helix ensures the stable intersubunit conformational transmission through external ligand binding first and internal ligand binding later. Reverse binding order induces a, to our knowledge, novel but unstable swingout of beta-subunit Hybrid domain with the retained close states of both alpha l and beta l domains. Prebinding of external ligand greatly facilitates the following internal ligand binding and vice versa. These simulations furthered the under-standing in the outside-in activation of I-domain-containing integrins from the viewpoint of internal allosteric pathways
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