Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)
Not a member yet
181 research outputs found
Sort by
Температурная зависимость коллатеральной активности термостабильных рекомбинантных CRISPR-нуклеаз Cas12b, полученных одностадийной очисткой металл-хелатной хроматографией после гетерологической экспрессии
Get PDFThermostable CRISPR/Cas nucleases are considered as promising enzymes for development of next-generation DNA diagnostics by coupling loop-mediated isothermal amplification of nucleic acids (LAMP) with selective CRISPR/Cas detection of specific amplicons. In this paper, we present the results of testing the collateral activity of CRISPR nuclease AapCas12b and three variants of CRISPR nuclease BrCas12b (wild type and two mutants) obtained using simplified purification in the typical temperature range of LAMP - from 56°C to 72°C. It was shown that the use of one-step metal-chelate chromatography by excluding a stage of enzymatic removal of N-terminal sequences translated together with the target protein allows for obtaining recombinant CRISPR nucleases BrCas12b with a sufficiently high level of collateral activity. Temperature dependences of collateral activity differed among the studied BrCas12b variants. The obtained results can be useful in selecting thermostable CRISPR nucleases Cas12b for development of test systems based on a combination of LAMP and CRISPR/Cas detection.Термостабильные CRISPR/Cas-нуклеазы рассматриваются как перспективные ферменты для создания ДНК-диагностикумов нового поколения путем сопряжения петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) с селективной CRISPR/Cas-детекцией специфичных ампликонов. В настоящей работе представлены результаты тестирования коллатеральной активности CRISPR-нуклеазы AapCas12b и трех вариантов CRISPR-нуклеазы BrCas12b (дикий тип и два мутанта), полученных с использованием упрощенной очистки, в типичном температурном диапазоне проведения LAMP – от 56°С до 72°С. Они показали, что применение одностадийной металл-хелатной хроматографии с исключением этапа энзиматического удаления N-концевых последовательностей, транслируемых вместе с целевым белком, позволяет получать рекомбинантные CRISPR-нуклеазы BrCas12b с достаточно высоким уровнем коллатеральной активности. Температурные зависимости коллатеральной активности различались у исследованных вариантов BrCas12b. Полученные результаты могут быть использованы при выборе термостабильных CRISPR-нуклеаз Cas12b для создания тест-систем на основе комбинирования LAMP и CRISPR/Cas-детекции
Сравнение результатов SPR анализа взаимодействия антиген-антитело, выполненного с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай)
Get PDFLimited availability of Western scientific equipment, explains a growing need to switch to using scientific instruments made in China. This is especially true in the case of optical biosensors operating on the surface plasmon resonance (SPR) effect. However, comparability of experimental data obtained using Western and Chinese biosensors has not been investigated yet. In this work we have comparedresults of SPR analysis of the kinetics and affinity of interaction of IgG2a and IgG1 antibodies with protein A. Two biosensos Biacore X-100 (“Cytiva”, USA) and MI-S200D (“Inter-Bio”, China) have been used. It was shown that the values of the association rate constants obtained on both devices for two antibodies were close within one order of magnitude. For IgG1 antibodies, the dissociation rate constants were almost identical. Both devices provide high-quality data that are well described by a simple 1:1 model (Langmuir binding).В настоящее время в связи с ограничениями доступности западного научного оборудования растет актуальность перехода на использование научных приборов, произведенных в Китае. Сказанное в полной мере относится к оптическим биосенсорам, работающим на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникают вопросы о сопоставимости экспериментальных данных, полученных с помощью биосенсоров западного и китайского производства. В данной работе были сопоставлены результаты SPR-анализа кинетики и аффинности взаимодействия антител IgG2a и IgG1 с белком А, полученные с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай). Было показало, что значения констант скорости ассоциации, полученных на обоих приборах для двух антител, близки в пределах одного порядка. Для антител IgG1 практически совпадают константы скорости диссоциации. Оба прибора дают высококачественные данные, которые хорошо описывались простой моделью 1:1 (Langmuir binding)
Способы определения индивидуальных аминокислот в биологических жидкостях
Get PDFDetermination of the amino acid composition of biological fluids is of great diagnostic importance. Commonly accepted methods of amino acid analysis include chromatography, electrophoresis and mass-spectrometry. However, for research purposes, to solve specific problems, it is often necessary to determine not the complete amino acid profile, but the concentration of individual amino acids. This review presents literature data analysis on methods used for determining individual amino acids in biological fluids. It is shown that amino acids can be determined by spectrophotometric, electrochemical methods, as well as using a wide range of biosensors, are the detection limit is basically comparable to chromatographic methods of analysis.Определение аминокислотного состава биологических жидкостей имеет важное диагностическое значение. К общепринятым методам анализа аминокислот относятся хроматографические, электрофоретические и масс-спектрометрические методы. Однако в исследовательских целях для решения частных задач зачастую возникает необходимость определения не полного аминокислотного профиля, а концентрации отдельных аминокислот. В настоящем обзоре представлен анализ литературных данных по методам определения индивидуальных аминокислот в биологических жидкостях. Показано, что определение аминокислот можно проводить спектрофотометрическими, электрохимическими методами, а также с использованием широкого набора биосенсоров, при этом предел обнаружения не уступает хроматографическим методам анализа
К вопросу о молекулярно-генетических механизмах взаимодействия остеобластов костной ткани с биологическими материалами при остеопластике
Get PDFThe article herein sets out to show the molecular and genetic mechanisms underpinning regenerative processes in bone tissue during the implantation of biological materials. The adhesion of osteoblasts to biological materials is a pivotal step in the transfer of physicochemical signals from biomaterials to osteoblasts. Initially, bone tissue cells interact with the biological material indirectly, through specific extracellular matrix proteins, especially vitronectin, fibronectin, and type I collagen. During the period preceding direct contact of osteoblasts with the implant, it is possible for blood proteins to be absorbed on the surface of the biological material in few seconds. Exactly the formation of a "protein layer" on the implants has been demonstrated to favour the adhesion of osteoblasts. The process of adhesion of osteoblasts to blood proteins is facilitated by a specific sequence, RGD, a tripeptide consisting of the amino acids Arg, Gly and Asp. This sequence is characteristic of vitronectin, fibronectin, type I collagen, osteopontin, bone sialoprotein and thrombospondin. Integrin-related signalling pathways can be categorised into two distinct types: those that are contingent on the Src-FAK complex and those that are not. It has been established that the phosphorylation of FAK at various sites can trigger multiple signalling pathways, including the PI3K/Akt/mTOR pathway, the Ras/MAPK/ERK1/2 pathway, and the p130Cas-RhoA GTPase pathway. For signalling pathways whose action is not contingent on the Src-FAK complex, integrin-linked kinase (ILK) is a pivotal regulatory factor. Among other significant cell membrane proteins, cadherins have been demonstrated to function as signal transduction molecules, contributing to the regulation of critical cellular activities. Consequently, in addition to the physical attachment of osteoblasts to biomaterials, cell adhesion leads to the activation of several signalling pathways, among which integrin- and cadherin-related signalling pathways are the most significant.В статье обсуждаются молекулярно-генетические механизмы восстановительных процессов в костной ткани при имплантации биологических материалов. Адгезия остеобластов на биологических материалах является ключевым этапом в передаче физико-химических сигналов из биоматериалов в остеобласты. Клетки костной ткани вначале взаимодействуют с биологическим материалом опосредованно, через специфические белки внеклеточного матрикса, особенно витронектин, фибронектин и коллаген I типа. В течение нескольких секунд, опережая прямой контакт остеобластов с имплантатом, белки крови могут сорбироваться на поверхности биологического материала. Именно образование «белкового слоя» на имплантатах благоприятствует адгезии остеобластов. Остеобласты соединяются с белками крови с помощью специфической последовательности RGD, трипептида Arg-Gly-Asp, характерного для витронектина, фибронектина, коллагена I типа, остеопонтина, костного сиалопротеина, тромбоспондина. Связанные с интегринами сигнальные пути могут быть разделены на два типа: сигнальные пути, зависимые от комплекса Src-FAK, и сигнальные пути, независимые от комплекса Src-FAK. Различные сайты фосфорилирования молекулы FAK могут инициировать ряд путей, включая путь PI3K/Akt/mTOR, путь Ras/MAPK/ERK1/2 и путь p130Cas-RhoA GTPаза. Для сигнальных путей, действие которых активируется вне зависимости от комплекса Src-FAK, важным регуляторным фактором является интегрин-связанная киназа (ILK). Среди других важных клеточных мембранных белков кадгерины могут также служить сигнальными молекулами трансдукции, вовлеченными в регуляцию важных клеточных активностей. Таким образом, помимо физического прикрепления остеобластов к биоматериалам клеточная адгезия приводит к активации нескольких сигнальных путей, среди которых связанные с интегринами и кадгеринами сигнальные пути являются наиболее важными
Влияние матриклеточного белка тенасцина-с на функциональную активность фибробластов в экспериментальной модели повреждения in vitro
Get PDFWound healing is a complex, multistep process involving sequential phases of inflammation, proliferation, and remodeling. Tenascin-C (TNC) is a matricellular protein actively involved in tissue regeneration. It is upregulated in response to tissue injury and plays an important role in the regulation of cell adhesion, migration, proliferation, and extracellular matrix protein synthesis. At the same time, during the early stages of wound healing, interleukin-1α (IL1α) exerts a significant effect as an alarmin that initiates inflammatory activation of fibroblasts. The objective of this study was to determine the optimal concentration of TNC stimulating both the migratory and synthetic activity of human dermal fibroblasts in vitro, including under conditions of preliminary inflammatory activation with IL1α. To this end, a comparative analysis of cell migration and proliferation was conducted, along with measurement of type I collagen synthesis using DF-1 human fibroblast cultures pre-incubated with IL1α (50 ng/mL) for 24 h, followed by the addition of recombinant TNC at concentrations of 0.05 μg/ml, 0.2 μg/ml, and 1 μg/mL. TNC exhibited a dose-dependent effect on fibroblasts: at a concentration of 0.2 μg/ml it stimulates cell migration and proliferation, accompanied by a statistically significant increase in type I collagen synthesis compared with the control. However, this level was lower than that observed at 1 μg/mL TNC, where a marked increase in collagen production was detected. Under conditions of IL1α pre-stimulation, the effects of TNC were amplified, particularly at concentrations of 0.2 μg/ml and 1 μg/ml, indicating the potential of TNC as a regulator of cellular activity within an inflammatory microenvironment. Higher concentrations did not further increase the effect. These findings may relevant in the context of to the development of biomaterials and therapeutic agents aimed at accelerating cutaneous wound healing by modulating cellular activity, which is especially relevant for the treatment of chronic or non-healing wounds.Заживление ран представляет собой сложный многоступенчатый процесс, включающий последовательные фазы воспаления, пролиферации и ремоделирования. Одним из белков, активно вовлекаемых в процессы репарации, является матриклеточный белок тенасцин-С (TNC), который синтезируется в ответ на повреждение тканей и активно участвует в регуляции клеточной адгезии, миграции, пролиферации и синтезе белков внеклеточного матрикса. В то же время на ранних стадиях заживления ран значительное влияние оказывает интерлейкин-1 альфа (IL1α), выступающий в роли алармина, инициирующего воспалительную активацию фибробластов. Целью данной работы было определить оптимальную концентрацию TNC, способствующую стимуляции миграционной и синтетической активности фибробластов кожи человека in vitro, в том числе в условиях предварительной воспалительной активации с помощью IL1α. Для этого проводили сравнительный анализ миграции и пролиферации клеток, а также измеряли уровень синтеза коллагена I типа с использованием культуры фибробластов человека DF-1 при инкубации с IL1α (50 нг/мл) в течение 24 часов и последующего добавления рекомбинантного TNC в конечных концентрациях: 0.05 мкг/мл, 0.2 мкг/мл и 1 мкг/мл. TNC оказывал дозозависимое влияние на фибробласты: в концентрации 0.2 мкг/мл он стимулировал миграцию и пролиферацию клеток, что сопровождалось статистически значимым увеличением синтеза коллагена I типа по сравнению с контролем, однако этот уровень был ниже, чем при концентрации TNC 1 мкг/мл, где наблюдали выраженное увеличение продукции коллагена. В условиях предварительной стимуляции IL1α влияние TNC усиливалось, особенно при концентрациях 0.2 мкг/мл и 1 мкг/мл, что свидетельствует о потенциале TNC как регулятора клеточной активности в воспалительном микроокружении. Использование более высоких доз не приводило к дополнительному усилению эффекта. Полученные данные могут быть использованы при разработке биоматериалов и терапевтических агентов, направленных на ускорение заживления кожных ран за счёт модуляции клеточной активности, что особенно актуально при лечении хронических или длительно заживающих ран
Влияние адъювантов на антигенные свойства пептидных конструкций из фрагментов оболочечного белка Е2 вируса гепатита С
Get PDFEffectiveness of the immune response in the form of the production of specific antibodies against immunogenic peptide constructs composed of conservative fragments of the hepatitis C virus envelope protein E2 depended on the adjuvants and carriers used in their preparations. The most effective formation of specific antibodies was observed in response to the injection of peptide constructs containing B- and T-epitopes of the E2 protein conjugated with a carrier with adjuvant properties, Immunomax. Antibodies obtained in response to immunization with conjugates of peptide constructs with Immunomax bound both hepatitis C virus envelope protein E2 and the heterodimer of envelope proteins E1E2.Показано, что эффективность иммунного ответа в виде продукции специфичных антител против иммуногенных пептидных конструкций, составленных из консервативных фрагментов оболочечного белка Е2 вируса гепатита С, зависит от использованных в составе препаратов адъювантов и носителей. Наиболее эффективное образование специфичных антител отмечено в ответ на введение пептидных конструкций, содержащих В- и Т-эпитопы белка Е2, конъюгированных с носителем с адъювантными свойствами Иммуномаксом. Антитела, полученные в ответ на иммунизацию конъюгатами пептидных конструкций с Иммуномаксом, связывали оболочечный белок Е2 и гетеродимер оболочечных белков Е1Е2 вируса гепатита С
Изменения биохимических параметров при остром пиелонефрите на различные триместры беременности до и после лечения
Get PDFGestational pyelonephritis is characterized by an annual increase in morbidity and complications, which negatively affect the course of pregnancy and childbirth in 3-17% of women in Russia. The discrepancy within the normally balanced oxidant-antioxidant system underlies the pathogenesis of many diseases of pregnant women, with a significant role atributed to oxidative stress and systemic inflammatory response. Biochemical laboratory parameters of systemic inflammation, oxidant-antioxidant system and endothelial dysfunction in peripheral blood plasma and urine were studied.The study included 115 women (mean age 25.1±4.3 years), divided into groups: comparison - 20 healthy women, 20 nonpregnant patients with a verified diagnosis of acute serous pyelonephritis; main groups of 15 women each: three groups with acute pyelonephritis in the 1st, 2nd and 3rd trimesters of pregnancy before and after basic therapy and two groups with acute pyelonephritis in the 2nd and 3rd trimesters of gestation with the inclusion of Viferon in the basic treatment. At all periods of gestation in conditions of acute pyelonephritis, to a greater extent in the 2nd and 3rd trimesters, the development of systemic inflammation, oxidative stress and endothelial dysfunction was established, as evidenced by an increase in the content of stable metabolites of nitric oxide, acyl hydroperoxides, malonic dialdehyde, markers of systemic inflammatory response (C-reactive protein and neopterin) in the plasma of peripheral blood and urine, a decrease in antioxidant defense factors and the level of endothelin-1. Incomplete relief of metabolic disorders by basic therapy was revealed, especially in the late stages of gestation. The inclusion of Viferon in traditional therapy of acute pyelonephritis in the 2nd and 3rd trimesters was more effective of pregnancy.Гестационный пиелонефрит характеризуется ежегодным ростом заболеваемости и осложнений, которые отрицательно сказываются на течении беременности и родов у 3-17% женщин в России. Несоответствие внутри сбалансированной в норме оксидантно-антиоксидантной системы лежит в основе патогенеза многих болезней беременных женщин, при этом значимую роль отводят оксидативному стрессу и системному воспалительному ответу. В данной работе изучены биохимические лабораторные параметры системного воспаления, оксидантно-антиоксидантной системы и эндотелиальной дисфункции в плазме периферической крови и моче беременных женщин с острым пиелонефритом. В исследование были включены 115 женщин (средний возраст 25.1±4.3 года), разделенных на группы: сравнения – 20 здоровых женщин и 20 небеременных пациенток с верифицированным диагнозом острый серозный пиелонефрит; основные группы по 15 женщин в каждой: три группы с острым пиелонефритом на 1, 2 и 3 триместре беременности до и после базисной терапии и две группы с острым пиелонефритом на 2 и 3 триместре гестации с включением препарата Виферон в базисное лечение. На всех периодах гестации в условиях острого пиелонефрита, в большей степени на 2 и 3 триместре, установлено развитие системного воспаления, окидативного стресса и эндотелиальной дисфункции, о чем свидетельствовало повышение в плазме периферической крови и моче содержания стабильных метаболитов оксида азота, ацилгидроперекисей, малонового диальдегида, маркеров системной воспалительной реакции (С-реактивный белок и неоптерин), снижение факторов антиоксидантной защиты и уровня эндотелина-1. Выявлено неполноценное купирование нарушений метаболизма базисной терапией, особенно на поздних этапах гестации. Включение Виферона в традиционную терапию острого пиелонефрита на 2 и 3 триместре беременности оказалось эффективным
Протоколы протеомного анализа: выделение, солюбилизация белков и гидролиз белков протеазами
Get PDFHigh-throughput studies of protein composition of biological samples have become routine and are used practically in all areas of life sciences. Modern proteomics methods allow reliable identification and quantification of thousands of proteins in a single experiment. The standard procedure for proteomic analysis includes the following steps: 1. isolation and solubilization of proteins, their hydrolysis by proteases; 2. analysis of the resulting peptides by high-performance liquid chromatography with mass spectrometric detection; 3. bioinformatics and statistical processing of the results. This paper presents protocols of the first stage of proteomic analysis, i.e. sample preparation, which are routinely used in the Laboratory of Systems Biology of the Institute of Biomedical Chemistry.Высокопроизводительные исследования белкового состава биологических образцов в настоящее время стали рутинными и используются практически во всех направлениях науки о жизни. Современные методы протеомики позволяют провести достоверную идентификацию и количественную оценку тысяч белков в одном эксперименте. Стандартная процедура протеомного анализа включает следующие стадии: 1. солюбилизация и выделение белков и их последующий гидролиз протеазами; 2. анализ образовавшихся пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием; 3. биоинформатическая и статистическая обработка результатов. В данной работе представлены протоколы первого этапа протеомного анализа – пробоподготовки, которые рутинно используются в лаборатории системной биологии Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича
ДНК-повреждающее действие и индукция апоптоза в клетках карциномы шейки матки под воздействием новых производных фосфониевых солей
Get PDFThis study demonstrates that (Z)-(2-(2-hydroxy-5-chlorophenyl)-2-phenylethenyl)alkyldiphenylphosphonium chlorides exhibit high antitumour activity, comparable to that of the reference drug doxorubicin. The phosphonium salts exhibited reduced toxicity towards conditionally normal cell lines in the majority of cases. The mechanism of action of compound PP8, which contains an octyl radical at the phosphorus atom, on the model cell line M-HeLa included partial cell cycle arrest in the G1 phase, an increased generation of reactive oxygen species, and an induction of mitochondrial apoptosis. These experimental data are supported by the elevated levels of p53, p21, H2A.X and caspase-9 proteins detected by multiplex analysis. The results indicated the occurrence of double-strand DNA breaks under the influence of the studied compound. Therefore, additional structural modifications to enhance the selectivity of the studied compounds will provide a basis for the development of novel effective antitumour agents.Выявлена высокая цитотоксическая активность (Z)-(2-(2-Гидрокси-5-хлорфенил)-2-фенилэтенил)алкилдифенилфосфоний хлоридов на уровне препарата сравнения доксорубицина. Протестированные фосфониевые соли в большинстве случаев оказались менее токсичными в отношении условно-нормальных клеточных линий. На примере соединения РР8, содержащего октильный радикал при атоме фосфора, показана частичная остановка клеточного цикла в фазе G1, усиленная генерация активных форм кислорода, а также индукция митохондриального апоптоза опухолевых клеток M-HeLa. Экспериментальные данные подтверждаются повышенным уровнем белков р53, р21, H2A.X и каспазы-9, обнаруженным с помощью мультиплексного анализа, и свидетельствуют о возникновении двухцепочечных разрывов ДНК в результате воздействия исследованного соединения. Таким образом, дальнейшие структурные модификации с целью повышения селективности исследуемых соединений позволят рассматривать их в качестве платформы для создания новых эффективных химиотерапевтических агентов
Детекция супрессора опухолей почки DUSP9 в моче здоровых доноров
Get PDFThe DUSP9/MKP-4 belongs to the family of bispecific protein phosphatases that negatively regulate MAP kinases (ERK, p38 and JNK). The expression of DUSP9 is significantly (20-80-fold) reduced compared to normal tissue in 95% of the studied human renal cell carcinoma samples. These and other scientific data indicate that DUSP9 is an attractive target for the use in clinical practice. However, so far, postoperative tumor biopsy samples remain the only source of clinical material in which expression of DUSP9 has been studied. This significantly limits the possibilities of using DUSP9 for clinical purposes. The purpose of this work was to find out whether it would be possible to detect DUSP9 in human urine. In the study we used human kidney carcinoma ACHN cells transfected with a vector, expressing DUSP9 and urine samples from 3 healthy volunteers. DUSP9 protein was detected by the Western blot method in precipitates obtained by centrifugation. We have shown that the DUSP9 protein is present in the pellet of the urine fraction obtained by low-speed centrifugation (10000 g). It is also present in the fraction of extracellular vesicles enriched with exosomes. The obtained result indicates that the analysis of DUSP9 expression is possible using a liquid biopsy, which, in turn, can significantly expand the applicability of this analysis for clinical purposes.DUSP9/MKP-4 принадлежит к семейству биспецифических протеинфосфатаз, негативно регулирующих MAP-киназы (ERK, p38 и JNK). Экспрессия DUSP9 значительно (20-80-кратно) снижена по сравнению c нормальной тканью в 95% исследованных образцов почечно-клеточной карциномы человека. Эти и другие научные данные указывают на то, что DUSP9 является привлекательной мишенью для использования в клинической практике. Однако до сих пор единственным источником клинического материала для исследования экспрессии DUSP9 служили постоперационные биопсийные образцы опухоли. Это значительно ограничивает возможности использования DUSP9 в клинических целях. Целью настоящей работы была оценка возможности обнаружения DUSP9 в моче человека. В работе использовали клетки карциномы почки человека ACHN, трансфицированные DUSP9-экспрессирующим вектором, и образцы мочи 3 здоровых добровольцев. DUSP9 белок детектировали, используя метод Вестерн-блота в лизатах осадков, полученных методом центрифугирования. Мы показали, что белок DUSP9 содержится в осадке фракции мочи, полученной при низкоскоростном центрифугировании (10000 g). Также он присутствует во фракции внеклеточных везикул, обогащенных экзосомами. Полученный результат свидетельствует о том, что анализ экспрессии DUSP9 возможен с помощью жидкостной биопсии. Это может существенно расширить применимость этого анализа в клинических целях